一、首先安裝ImageJ+ file-open

windows用戶直接安，IOS的老鐵們先安裝個JAVA環(huán)境（從JAVA官網(wǎng)就能下來），再安裝image J（從官網(wǎng)也能下來）?？偟膩碚f還是一勞永逸的，不算很麻煩，我們科研都做了還怕什么麻煩，使用方法不管哪個版本都差不多。打開圖片這種老年人操作就不用介紹了吧……不好意思桌面有點亂……

二、將圖片轉(zhuǎn)換成黑白

如圖所示，image-type-8-bit

三、調(diào)整閾值

image-adjust-threshold打開調(diào)整界面，把原圖放在一邊，邊調(diào)節(jié)畫圈的位置邊看著原圖，以防用力過猛或隔靴搔癢。上下兩個數(shù)可以是0/128或28/76什么的，看起來細胞盡量都黑了，背景也比較白就差不多了，不用苛求兩個數(shù)非得是多少。還要調(diào)到B&W，Dark background。都好了之后按apply,就可以關(guān)掉閾值界面了~

四、分割

上一張圖所有接觸的細胞還都是一片，這么計數(shù)肯定會少，所以這一步用watershed把連在一起的細胞分開。process-binary-watershed,細胞被分開了吧

五、分析數(shù)量

analyze-analyze particles打開分析窗口

我的重要創(chuàng)新點就是這個調(diào)整大小，從0.005開始算起，否則臟的背景也要被計算進去了（0.005也不是絕對的，可以適當調(diào)整，根據(jù)照片質(zhì)量不同，我在計數(shù)的時候也用過0.008，0.01，0.015不等）。勾選show  outlines, display results，選好了之后點OK

六、結(jié)果展示

嗒噠~軟件說這一張皂片有257個細胞，俺看它勾選的還挺準，就醬！

之后把數(shù)據(jù)寫到Excel里去做統(tǒng)計就完工了~介于版面還有挺多地方我就再總結(jié)一下預(yù)實驗里的種種艱辛

1、第一次是按照我?guī)熃懔粝碌膒rotocol，那個歲月里的matrigel膠還是風(fēng)華正茂的，1：20三個小時也就凝固了。到了我這代的時候膠已經(jīng)風(fēng)燭殘年，第一次做這個實驗整整5個小時這個膠還像果凍爽一樣瀟灑，并沒有像果凍一樣凝固，但是硬著頭皮也做了。

解決方案：做一個1：5，1：7，1：10，1：15的梯度預(yù)實驗，最終選定了1：8三個小時的包被為準。

2、染色的時候傳說中要用棉簽擦拭，作為一個科研鱉我深以為既然穿過去了肯定就不會掉了，之后拿著棉簽把白花花的細胞擦了個干凈……

解決方案：后來才知道輕輕擦就是把棉簽頭抓成雞窩，在用那種和沒擦一樣的力度來個假動作。之前該掉下來的細胞也在三次沖洗之下不復(fù)存在了。

3、結(jié)晶紫也是我?guī)熃隳谴慕Y(jié)晶紫，瓶子上沒寫濃度，天真的我就直接拿來用了，直到有一天我?guī)熃愀嬖V我那個是原液……原液……原液……

解決方案：來歷不是特別清楚的東西用之前最好要查好說明書，上官網(wǎng)輸入貨號，比如我那瓶上古結(jié)晶紫就應(yīng)該用PBS稀釋10倍，染色15分鐘，自來水沖洗干凈。

4、我以為的包被3小時就是3小時后處理細胞嗎？拿衣服！作為有n組細胞m個小室的一次實驗難道還妄想在瞬間完成洗，消化，離心，重懸，計數(shù)，計算，重懸，種板這么多操作嗎？第一次正式試驗，當我把細胞處理完已經(jīng)包被了4小時了，膠干大勁了。

解決方案：提前算好操作時間，在包被后3小時精準地把細胞加進去。

5、師兄說把小室放到載玻片上，倒置顯微鏡拍照。結(jié)果怎么也拍不好，同一個視野不管怎么調(diào)焦都是一部分清楚一部分模糊。后來我發(fā)現(xiàn)是那個膜會像腳一樣站著，把整個東西支起來了，而且不平。

解決方案：剪膜太麻煩，是時候發(fā)揮俺聰明才智了，我把小室塞到了復(fù)蘇細胞的浮漂上，平與不平，盡在掌握