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1. 細(xì)胞遷移 ① 有的細(xì)胞有鞭毛或纖毛，通過(guò)鞭毛或纖毛擺動(dòng)就能運(yùn)動(dòng)，如精子；② 通過(guò)細(xì)胞的變形，帶動(dòng)細(xì)胞的移動(dòng)，如肌動(dòng)蛋白 Actin 的聚合狀態(tài)發(fā)生改變帶動(dòng)細(xì)胞變形。△Actin 是細(xì)胞骨架的組分之一，Actin 的聚合能使細(xì)胞形成突出的角，Actin 在這個(gè)角不斷加聚，就能不斷伸出，隨后細(xì)胞邊緣也發(fā)生相應(yīng)變化，從而帶著細(xì)胞移動(dòng)。用帶熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染 Actin，看 Actin 的排列是否改變，沒(méi)有運(yùn)動(dòng)起來(lái)的細(xì)胞，Actin 排列是規(guī)整的，運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞 Actin 排列就會(huì)變得紊亂，能看到延伸出來(lái)的角，細(xì)胞極性也發(fā)生改變。此外，還可以檢測(cè)促進(jìn) Actin 聚合的分子的表達(dá)，如 Arp2/3 復(fù)合物、mDia1、mDia2。 ③ 細(xì)胞膜流動(dòng)：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)，細(xì)胞膜是循環(huán)流動(dòng)的，外面的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜庫(kù)發(fā)生交換，導(dǎo)致細(xì)胞遷移。 ④ 細(xì)胞移動(dòng)時(shí)還會(huì)涉及細(xì)胞核的重定位、高爾基體的重定向、微管組織中心的重定向。 細(xì)胞和細(xì)胞之間有細(xì)胞連接，細(xì)胞要能運(yùn)動(dòng)，就要先從原位置脫落下來(lái)，細(xì)胞粘附能力發(fā)生改變（粘附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)胞連接、細(xì)胞與基質(zhì)連接的相關(guān)蛋白的表達(dá)，如整合素蛋白；效應(yīng)器蛋白的表達(dá)，如 Rho GTP 酶；細(xì)胞粘附相關(guān)的信號(hào)通路分子如 FAK、Src、Paxillin、Crk、PAK、GIT；能破壞粘附復(fù)合物的蛋白酶的表達(dá)）； 體外培養(yǎng)細(xì)胞是讓細(xì)胞在一個(gè)支持物上，細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面長(zhǎng)成單層細(xì)胞（2D），檢測(cè)單層細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)可以用 劃痕實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)細(xì)胞是否具有運(yùn)動(dòng)能力。
2. 檢測(cè)細(xì)胞遷移：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的原理 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Scratch assay or wound-healing assay）： 先讓細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，細(xì)胞之間沒(méi)有空隙，沒(méi)有足夠的空間可以移動(dòng)；然后刮除一些細(xì)胞（造成“傷痕”），留出一些空間，如果細(xì)胞能迅速往這些空著的地方爬，說(shuō)明細(xì)胞有遷移能力。 為了保證細(xì)胞是自己爬過(guò)去而不是因?yàn)榧?xì)胞增殖被擠過(guò)去的，就需要用絲裂霉素處理，讓細(xì)胞停止增殖；或者劃出劃痕后，把培養(yǎng)基換成無(wú)血清的培養(yǎng)基（有的細(xì)胞對(duì)無(wú)血清不耐受，可以少加點(diǎn)血清，維持細(xì)胞的狀態(tài)） ，細(xì)胞在無(wú)血清的環(huán)境中生長(zhǎng)極其緩慢，可以認(rèn)為細(xì)胞不增殖。 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞在 2D 空間的遷移。
劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的操作流程 標(biāo)記 6 孔板：使用 marker 筆在 6 孔板的外底面畫(huà)平行線(xiàn)。平行線(xiàn)間距約 0.5cm，線(xiàn)畫(huà)直一點(diǎn)，為了保證后續(xù)拍照位置是相同的。 制備細(xì)胞懸液：胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。 鋪 6 孔板：細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪板，保證每組細(xì)胞鋪板密度一致，且密度控制在第二天長(zhǎng)滿(mǎn)單層（提前摸索）。若過(guò)夜后細(xì)胞未完全長(zhǎng)滿(mǎn)，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但如果細(xì)胞密度已經(jīng)很大，盡量重新鋪板，因?yàn)榭赡苓^(guò)一天后細(xì)胞太滿(mǎn)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。 制造劃痕 ：用直尺比著，使用 10ul 槍制造細(xì)胞劃痕（槍尖的平面垂直緊貼著培養(yǎng)板平面劃過(guò)細(xì)胞層，最好保持力度一致，盡量一次性劃完，保證每個(gè)劃痕的寬度一樣） ，劃痕方向與標(biāo)記線(xiàn)垂直。 
劃痕后用顯微鏡照相，作為 0h 對(duì)照。保存圖片為 TIF 格式。 洗：吸去培養(yǎng)基，PBS 輕柔洗 3 次，充分洗去漂浮細(xì)胞。PBS 清洗時(shí)動(dòng)作輕柔，貼壁緩慢加入，不要把貼壁細(xì)胞洗掉。 換液：換無(wú)血清培養(yǎng)基，或低血清培養(yǎng)基（FBS≤2%），將細(xì)胞放入 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 定時(shí)拍照或?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)：選擇合適時(shí)間點(diǎn)拍照，如 0h，6h，12h，24h 后取出細(xì)胞于顯微鏡下拍照。一般認(rèn)為 24h 為細(xì)胞的一個(gè)周期，所以檢測(cè)時(shí)間最好不要超過(guò)一個(gè)周期的時(shí)間。每次拍照前都用 PBS 洗 3 次，充分洗去漂浮細(xì)胞。
◆ 以預(yù)先做好的標(biāo)記為定點(diǎn)觀測(cè)點(diǎn)來(lái)進(jìn)行定時(shí)拍照（每 4 小時(shí)觀察劃痕愈 合情況，選擇處理/對(duì)照組遷移能力差異明顯的時(shí)間點(diǎn)拍照。拍攝與 0h 拍照時(shí)的相同位置，放大倍數(shù)（100×）相同），或者使用實(shí)時(shí)檢測(cè)設(shè)備 進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。 ◆ 劃痕與孔板背后 5 條標(biāo)記線(xiàn)之間有 5 個(gè)交點(diǎn)，每個(gè)交點(diǎn)的線(xiàn)上和線(xiàn)下各 一個(gè)定點(diǎn)觀測(cè)的區(qū)域，即每個(gè)孔共有 10 個(gè)定點(diǎn)觀測(cè)區(qū)域，每次拍照就 拍這 10 個(gè)區(qū)域，拍照時(shí)標(biāo)記線(xiàn)不要出現(xiàn)在視野內(nèi)，而是剛好沿著標(biāo)記 線(xiàn)的邊拍照。 ◆ 細(xì)胞生長(zhǎng)具有邊緣效應(yīng)，所以邊緣細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可能與中間的細(xì)胞不太 一樣，不宜作為觀測(cè)點(diǎn)，去掉 1 和 10，最后可能只剩下中間 8 個(gè)甚至 6 個(gè)觀測(cè)點(diǎn)。 
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 
數(shù)據(jù)處理與繪圖 
U 未誘導(dǎo)處理的細(xì)胞 I 經(jīng)誘導(dǎo)處理的細(xì)胞 3. 檢測(cè)細(xì)胞遷移：transwell 實(shí)驗(yàn) transwell 實(shí)驗(yàn)（transwell assay）檢測(cè)細(xì)胞遷移的原理 
需要特定孔徑的 transwell 板（transwell 小室）。 上室可以架在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔上，底部是一層帶很多小孔的薄膜（肉眼看不到孔，孔徑大小根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞大小來(lái)選擇，一般下室 24 孔板的用孔徑 8μm 的，腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)常用 8μm、12μm 膜），不接觸細(xì)胞培養(yǎng)板。 下室需要高血清，上室需要低血清，以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。 在上室低血清培養(yǎng)基中種過(guò)量的細(xì)胞，如果細(xì)胞沒(méi)有遷移能力，8μm 的孔徑小于細(xì)胞，上室中的細(xì)胞和培養(yǎng)液不能通過(guò)小孔進(jìn)入下室；有遷移能力的細(xì)胞能變形，下室鋪的培養(yǎng)基多加血清，促使細(xì)胞遷移到下室，細(xì)胞就會(huì)穿過(guò)小孔粘附在上室底膜的下表面（對(duì)于粘附能力弱的細(xì)胞，容易掉進(jìn)下室，就需要在種細(xì)胞前預(yù)先對(duì)上室膜的下表面涂一些增加細(xì)胞粘附的東西，如 10ug/ml 的纖連蛋白）。 結(jié)束實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果時(shí)，transwell 小室的上室膜上表面里會(huì)有大量沒(méi)有穿過(guò)孔的細(xì)胞累積，上室膜的下表面粘附著穿過(guò)小孔的細(xì)胞，用棉簽擦掉上室膜上表面的細(xì)胞，將上室放入染色液染色，使下表面的細(xì)胞著色，就可以在顯微鏡下拍照。 模擬細(xì)胞在 3D 空間的遷移。
transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的操作流程 撤血清：換無(wú)血清或低血清（5% FBS，無(wú)血清不耐受時(shí)）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，清除血清的影響。 鋪下室培養(yǎng)基：下室鋪含 20% FBS 的培養(yǎng)基（有些特殊實(shí)驗(yàn)可以加趨化因子）。 制備細(xì)胞懸液：胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。 鋪細(xì)胞：將上層小室放入下層小室，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞鋪在上層小室中（一般鋪 100ul 細(xì)胞，細(xì)胞要多一點(diǎn)）。 繼續(xù)培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，具體時(shí)間視不同細(xì)胞而定（不同細(xì)胞遷移能力不同，提前摸索時(shí)間，看細(xì)胞什么時(shí)候能穿過(guò)小孔。接種的細(xì)胞量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間非常重要，如果細(xì)胞數(shù)太多或是培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，都會(huì)使本來(lái)有遷移及侵襲能力差別的細(xì)胞之間的差別不顯著甚至是沒(méi)有。這個(gè)首先可以參考文獻(xiàn)的細(xì)胞用量及時(shí)間，再結(jié)合自己的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以剛開(kāi)始時(shí)不要做太多的處理組，而要把條件摸好再說(shuō)）。 擦去上層細(xì)胞：用棉簽（棉簽頭扯松一點(diǎn)，可以擦到邊角）擦去上層小室里的細(xì)胞。 固定細(xì)胞：甲醇室溫固定細(xì)胞 5min 或用 4%多聚甲醛室溫固定 20min（防止細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變） 。 吉姆薩染色：吉姆薩染色液染細(xì)胞，去離子水適度漂洗，去除浮色。（吉姆薩染色液染的色很容易被水洗掉，染色后稍微漂洗 1-2s 就立刻觀察細(xì)胞顏色） 拍照：把染色漂洗后的上室放在一片干凈的載玻片上，帶膜的底面貼著載玻片，拍照時(shí)不要讓細(xì)胞完全干燥，可以微微濕潤(rùn)，借助水的折射可以讓細(xì)胞拍出來(lái)更好看。拍照時(shí)，建議把上室底面按十字劃分，沿十字線(xiàn)拍一遍，再把四角各拍一張，相當(dāng)于把整個(gè)底面掃了一遍。
transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 
數(shù)據(jù)處理與繪圖 參考：應(yīng)用Image J進(jìn)行Transwell遷移細(xì)胞計(jì)數(shù) 
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