腫瘤惡性化表型研究，最常見(jiàn)的為細(xì)胞遷移，細(xì)胞侵襲，細(xì)胞增殖的研究。今天為大家介紹一下其對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)原理與方法。

一：檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞劃痕。

（1）實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)室研究細(xì)胞遷移的最常用的體外試驗(yàn)方法。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 細(xì)胞密度約80-90%時(shí)，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分盤。首先加入預(yù)熱的胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿形成單個(gè)或者團(tuán)狀的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。然后輕輕吹打混勻細(xì)胞，將細(xì)胞均勻種于六孔板。

2. 24h后，待細(xì)胞均勻鋪滿，用槍頭比著直尺，垂直劃一條直線，注意槍頭要垂直，不能傾斜。注意保證實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組寬度相近。由于機(jī)械劃痕時(shí)會(huì)對(duì)邊緣的細(xì)胞造成損傷，可以選擇購(gòu)買劃痕插件，即避免細(xì)胞損傷又能保證細(xì)胞寬度相同。

3. PBS輕洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。

4. 放入37度5%CO2培養(yǎng)箱。按0， 12，24小時(shí)取樣，拍照。拍照時(shí)“劃痕”的方向最好在視野內(nèi)為水平的或者垂直的。

二：檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，最常用的實(shí)驗(yàn)方法為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

（1）實(shí)驗(yàn)原理：利用一層膜（基質(zhì)膠）將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開(kāi)，細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了尋找營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)往高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面遷移。主要是模擬細(xì)胞分泌金屬蛋白酶消化細(xì)胞外基質(zhì)，轉(zhuǎn)移至其他組織的過(guò)程。由于只有具有侵襲能力的細(xì)胞才可進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。因此實(shí)驗(yàn)前最好先用明膠酶譜法檢測(cè)MMPs的表達(dá)。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，去除血清的影響。

2. 在無(wú)菌條件下將Matrigel膠冰浴融化。然后用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋配制Matrigel ，比例1：4-1：8，稀釋后在Transwell小室上室鋪40ul/孔。

3. 37℃放置2h，至Matrigel膠凝固,用無(wú)血清培養(yǎng)基水化30min。

4. 用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿形成單個(gè)或者團(tuán)狀的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。

5. PBS輕洗細(xì)胞3次，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10×105細(xì)胞處理后，取10萬(wàn)細(xì)胞鋪到上室。

6. 48h后待細(xì)胞穿到下室，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。小室于室溫徹底風(fēng)干，以方便后一步染色。

7. 0.1%結(jié)晶紫染色。

8. PBS洗去多余結(jié)晶紫。

9. Transwell小室與正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

三：檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，最常用的實(shí)驗(yàn)為CCK8增殖實(shí)驗(yàn)。

注：科研小助手在之前詳細(xì)講解過(guò)MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)

（1）實(shí)驗(yàn)原理：WST-8在電子耦合載體1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。對(duì)于許多腫瘤耐藥株，可以在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組加入藥物處理后，可以通過(guò)cck8檢測(cè)使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映細(xì)胞活性。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液后，取 96孔板，每空加入100μL。置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5% CO2）。在96孔板的四圍可以加入PBS，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中液體蒸發(fā)過(guò)多。

2. 12、24、48小時(shí)分別向培養(yǎng)板加入待測(cè)藥物試劑。

3. CCK8檢測(cè)：

（1）棄去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100ul培養(yǎng)基，向每孔加入10μLCCK8溶液。其中預(yù)留的PBS孔加入CCK8作為空白組。

（2）將培養(yǎng)板在37度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4h。

（3）酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。

細(xì)胞活性計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100

其中：

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度。

A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度。

A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度細(xì)胞活力。

各位讀者：