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很多戰(zhàn)友肯定現(xiàn)在都做過關(guān)于細胞遷移的實驗。 其中劃痕法以其材料廉價，操作簡單而多年來一直深受大家的歡迎。 我這里介紹一下我自己的操作過程和結(jié)果圖。希望能給新來的戰(zhàn)友們以幫助。 材料： 6 孔板（其他的也可以，但感覺6孔比較好，大小適中） marker筆 直尺 20微升槍頭（滅菌） 無血清培養(yǎng)基 PBS 準備： 所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min（超凈臺內(nèi)） 流程： 1。先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。 2。在空中加入約5X105個細胞，具體數(shù)量因細胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。 3。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。 4。用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。 5。放入37度5%co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24小時取樣，拍照。 下面是照片，細胞NIH3T3 0h  6h NIH3T3  12h NIH3T3  24h NIH3T3  最后，歡迎各位正在奮斗的戰(zhàn)友過來一起討論，同時，申請版主加分：） 樓主的照片很漂亮但是用六孔板我覺得有些浪費，我們實驗室常用的是96孔板，可以同時做很多平行復孔。不知你照片拍完了之后用什么軟件統(tǒng)計劃痕的寬度呢，我們一般使用共聚焦顯微鏡自帶的軟件。你能把統(tǒng)計方法介紹一下嗎？ 老實說，我們實驗室沒有什么好的軟件。所以一般只作定性，不作定量。 如果樓上有好的軟件能否共享一下，不勝感謝。 6空板可以保證有相當距離的平直劃痕，我覺得挺不錯的。而且因為有5條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點，不作重復，誤差也很小。 細胞遷移實驗是做什么研究的啊，不是很懂 感謝，學到寶貴經(jīng)驗！ 謝謝樓主，照片很漂亮，實驗步驟也很清楚。 需要提醒樓主的是：如果你連續(xù)監(jiān)測24小時，你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細胞遷移。如果你要單純的考慮細胞遷移，你可以先用絲裂霉素處理一小時，抑制細胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細胞遷移的作用了。 照片拍完之后，可以用image J 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細胞遷移的速度。 恩,學習了不少, tacthgin wrote: 謝謝。無血清的話，應該一個細胞周期內(nèi)，增殖可以忽略吧。而且我定點監(jiān)測的話，差不多可以對應到每個細胞。好像沒有看見很明顯的增殖現(xiàn)象。絲裂霉素貌似很貴的說。。。如果用這個還不如直接用transwell呢。 另，image J 哪里有下載么？謝謝。 ImageJ 下載網(wǎng)址：http://rsbweb./ij/download.html 無血清培養(yǎng)，確實細胞增殖可以忽略了，不過由于細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細胞遷移的速度也會慢很多。不知道是不是大多數(shù)文獻都用無血清培養(yǎng)狀態(tài)下作劃痕實驗呢？你這不是“又叫馬兒跑，又叫馬兒不吃草么“。呵呵 tacthgin wrote: 謝謝，tacthgin戰(zhàn)友的提醒，確實存在這個問題。所以目前最好的方法還是transwell法。 一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清（《2%）否則細胞增殖就不能忽略。一般認為細胞周期是24小時，但對于一些特殊的細胞系來說，生長可能會快一點。因此好像還沒看見用帶血清培養(yǎng)，短時間檢測的。不過我會去試試看?？赡苁莻€好方法。 劃痕法的意義在于，價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細胞外圍環(huán)境簡單單純，容易控制。（比如做加藥的，可能會和血清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤差。如果是鋪了ECM物質(zhì)的，組分就更復雜了。） 劃痕法的不足也很明顯，適用的細胞系很窄，一般只能用于上皮，纖維樣細胞系。因為 1。這些細胞本身有遷移能力，且較強。 2。細胞有極性，方便測量，觀察。 3。細胞對無血清有較強的忍受力（至少24小時），因此很多腫瘤細胞系是不適合做劃痕的，很多腫瘤細胞系在無血清培養(yǎng)下，12小時細胞凋亡就超過50%。這也就是transwell發(fā)展的最大要求。而一些上皮樣細胞系甚至可以忍受高達72小時的無血清實驗。足以彌合劃痕。 另：在此貼出的圖片都是本人實驗數(shù)據(jù)，非將本人同意不得轉(zhuǎn)載，引用。如需要引用者，請同本人聯(lián)系協(xié)商。 一下是一種上皮樣細胞的48小時監(jiān)測圖?？梢钥吹絼澓垡呀鼜浐稀?  現(xiàn)在好多SCI雜志都不認這個實驗了， 要求做transwell了。 這個方法無法進行精確定量，前期做起來容易，后期數(shù)據(jù)處理比較麻煩，還得附圖，SCI雜志照片之昂貴，遠超過了transwell的價格。 Photoshop 6.0以前的版本有個直方圖的功能可以直接反映選擇區(qū)域的象素多少，用來做面積分析應當很好用，用于做劃痕修復的實驗應當也很好用，當然，有更專業(yè)的Image Pro Plus的話PS就沒必要了。 wuushark wrote: 本人正打算投稿呢，其中就包括劃痕實驗，能否請wuushark 指點一下哪些SCI雜志不認這個實驗呢？ 我個人認為選擇scratch assay 或者是 transwell assay 是根據(jù)所研究的細胞系的特點來決定的。 上皮細胞，癌細胞，角質(zhì)細胞，在生理狀態(tài)下，形成單層或者復層上皮，當病理狀態(tài)下，比如創(chuàng)傷愈合，細胞遷移的時候，以側(cè)向運動為主，scratch assay 很好的模擬了這種運動形式，是很好的模型。 neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 這類細胞在生理狀態(tài)下并不形成monolayer, 病理狀態(tài)下的細胞遷移是在細胞因子或趨化因子的影響下在基質(zhì)中縱向運動，transwell assay 模擬了這種運動形式，是適合的模型。 tacthgin wrote: 非常同意，tacthgin戰(zhàn)友的思想。其實在傷口彌合中，fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。但是其實癌細胞的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡單，我覺得應該是綜合效應，而且要看是什么類型的腫瘤。因為對于遠端病灶的轉(zhuǎn)移，顯然是通過血液運輸?shù)?。這是一個細胞去黏附和再黏附的過程。其實transwell也不能很好的模仿這個過程。只是transwell matrigel可以模仿腫瘤細胞融解基質(zhì)，侵入到正常組織的這個過程。也就是侵襲。所以對于做cancer的來說，可能transwell會更好些。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細胞的遷移作為細胞的一個正常生理活動，是表征細胞生理變化的一個重要指標。這點是很主要的意義。 不錯！ |
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