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細(xì)胞，怎么說呢？到現(xiàn)在我依然得第一次到細(xì)胞房的情形，第一天進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，是沒有操作的資格的，只能在旁邊看著，師傅讓我在顯微鏡里初略的看了一眼，其實(shí)我沒有看太清楚，也不確定自己看到的是不是，但看師傅實(shí)在忙也不好意思開口多問，只嗯了一聲。在他們實(shí)驗(yàn)的空檔，其他實(shí)驗(yàn)員跟我聊了起來，其中讓我印象最深的一句話是“下周我可以先給你一盤細(xì)胞養(yǎng)養(yǎng)看，我對(duì)它的了解就像農(nóng)民伯伯了解大糞一樣，你放心，肯定能教你養(yǎng)好，一個(gè)細(xì)胞養(yǎng)好了，其他的也就能融會(huì)貫通了” 做好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，就是養(yǎng)好細(xì)胞，同事的那句話，話雖糙，但理卻確實(shí)是這么個(gè)理。細(xì)胞跟人其實(shí)是一樣一樣的，人有高矮胖瘦，脾氣秉性不盡相同，細(xì)胞也是如此，他們的形態(tài)，包括圓形、梭形、桿狀、星形、多邊形或是其他不規(guī)則形狀，主要“食物”是DMEM跟1640，就跟我們?nèi)祟惖拿罪埜媸骋粯?，也有其他一些不太常?guī)的，比如F12、L15、McCoy's 5A等，一般情況下（特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，需要進(jìn)行細(xì)胞馴化的除外），不建議更換培養(yǎng)基品類，就像你讓上海小姑娘到重慶吃朝天辣火鍋一樣，它也要受不了的。除了保證日常的溫飽，還要給予一定的關(guān)注度，每天觀測(cè)細(xì)胞的時(shí)候看的仔細(xì)一點(diǎn)，增殖速率，細(xì)胞狀態(tài)等等，實(shí)驗(yàn)記錄一定要注意細(xì)節(jié)，尤其是那些經(jīng)過了“手術(shù)”的：轉(zhuǎn)染、侵染后的效率及細(xì)胞毒性；藥篩后的存活率；改造后細(xì)胞的形態(tài)、品性等等，待你跟它熟了，對(duì)它的脾氣秉性了解了，把它養(yǎng)的“白白胖胖”的，它自然也能配合好你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 首先說的是增殖及周期實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)放在一起，主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)都是細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞鋪板的時(shí)候要根據(jù)細(xì)胞的增長(zhǎng)速率，嚴(yán)格把握好鋪板密度，盡量保證所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)都能夠在細(xì)胞的指數(shù)增長(zhǎng)期完成，否則因?yàn)樯L(zhǎng)空間的限制后面的時(shí)間點(diǎn)可能都沒有參考價(jià)值，生長(zhǎng)周期太短也可考慮適當(dāng)?shù)慕档退袑?shí)驗(yàn)組的血清濃度，如對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期把握不是很大的話，可以考慮先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)及最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)即可。細(xì)胞的周期實(shí)驗(yàn)比較清晰，常規(guī)傳代后24或48h安排檢測(cè)即可，但也有異常的可能檢測(cè)不到S期，這就需要對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期再嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)一下，提前或延后檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。有些同學(xué)在固定的時(shí)候也會(huì)出些問題，固定完了之后細(xì)胞黏連，或者出現(xiàn)吹不散的細(xì)胞團(tuán)塊，堵機(jī)子。首先細(xì)胞黏連，第一考慮的是消化的時(shí)候，時(shí)間過長(zhǎng)，直接導(dǎo)致細(xì)胞黏連，這個(gè)問題出在固定之前，那么就要求細(xì)胞消化的時(shí)間把握好，比常規(guī)傳代的時(shí)候更精確一些，顯微鏡下看到細(xì)胞變圓即可處理；第二就是離心過程，離心后需將上清盡量吸棄，最好能用PBS再重懸洗滌一次。細(xì)胞結(jié)團(tuán)一般是固定的時(shí)候細(xì)胞沒有打散，不論是直接加預(yù)配好的固定液，還是先加PBS再加乙醇的方式，都需要將細(xì)胞輕輕打散。這樣基本可以順利完成上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 ■ ■■■■ 侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)，是關(guān)于細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及遷移能力的。侵襲目前一般都是用transwell小室，可以用買包被好的小室，也可以自己包被，這個(gè)一般沒有太大問題。侵襲一般先將細(xì)胞饑餓一段時(shí)間，正式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，上下室需要有血清濃度差。如果你的參考文獻(xiàn)及MMP等基因檢測(cè)都指向該細(xì)胞可以過膜而你的實(shí)驗(yàn)沒有過的話，考慮：一是細(xì)胞狀態(tài)，狀態(tài)差的話過膜能力也會(huì)差；二，下室的趨化因子不夠，血清濃度在允許范圍內(nèi)再進(jìn)行調(diào)整，或者加入條件培養(yǎng)基（即以正常細(xì)胞培養(yǎng)24后上清液與普通完培以一定比例混合）；三，細(xì)胞可能已經(jīng)過膜了，落在了下室，請(qǐng)微調(diào)一下你的顯微鏡，如是，可將實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)提前；四，是否因?yàn)榧?xì)胞過大，需要更換更大孔徑的小室（常規(guī)用8um）；五，也是所有人最不愿意遇到的，你用的可能是個(gè)假細(xì)胞，趕緊去做下STR鑒定吧。遷移實(shí)驗(yàn)一般有兩種方式，劃痕及transwell，transwell同上，只是不需要包被matrigel膠，問題的解決方案基本同上，其中只有一個(gè)注意點(diǎn)，因?yàn)闆]有鋪膠，8um的小孔在那，一般4-6小時(shí)后，上下室的血清濃度會(huì)達(dá)到平衡，建議，如果可以中途再補(bǔ)充一下血清。遷移實(shí)驗(yàn)的另外一種方法是劃痕，劃痕主要也是掌握細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，在細(xì)胞完全愈合之前完成所有時(shí)間點(diǎn)的監(jiān)測(cè)，另外把握好降低的血清濃度，盡量真實(shí)反映細(xì)胞的遷移能力，而不是增殖能力。 ■ ■■■■ 凋亡及其他涉及FACS檢測(cè)的。FACS相關(guān)檢測(cè)，染料的選擇要結(jié)合細(xì)胞的具體情況，如本身沒有帶熒光則可以自由選擇，如本身帶有熒光，請(qǐng)避開相關(guān)的熒光波段，如果實(shí)在沒有辦法避開，需要設(shè)置一個(gè)調(diào)補(bǔ)償組，正式實(shí)驗(yàn)前將熒光補(bǔ)償調(diào)整好。多個(gè)指標(biāo)檢測(cè)的，尤其要分清干擾波段。凋亡實(shí)驗(yàn)，收取樣品的時(shí)候一定要收集上清里的細(xì)胞，里面包括了凋亡及死亡的細(xì)胞，是整體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)里的一部分，消化的時(shí)候選用不含EDTA的胰酶，消除假陽(yáng)性。當(dāng)然凋亡還有其他檢測(cè)手法，如tunel或是DNA ladder等，這兩者，一般晚期凋亡多的話檢測(cè)結(jié)果會(huì)比較明顯，實(shí)驗(yàn)尤記得設(shè)好陽(yáng)性參照。 ■ ■■■■ 另外還有免疫熒光、免疫組化等等，這些可以細(xì)胞先做好爬片，也可以直接在孔板里做（孔板里做的話洗脫的時(shí)候需要小心，細(xì)胞容易漂），免疫相關(guān)的細(xì)胞固定及通透不能少，一抗孵育需充分，如過夜第二天取出的時(shí)候也可以在37度再放一會(huì)，二抗孵育及免疫組化后期的顯色時(shí)，陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照必不可少，時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有假陽(yáng)性，短了會(huì)有陰性。 ■ ■■■■ 以上，細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)還有許多許多，我接觸的可能也只是簡(jiǎn)單的一小部分，且做且珍惜，也希望在我歷走人間的歲月里，多經(jīng)歷它們更多不一樣的“人生”。 |
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