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解螺旋公眾號(hào)·陪伴你科研的第2492天 研究WNT通路，此綜述真是一場(chǎng)及時(shí)雨！ 之前我們?cè)?jīng)在《腫瘤通路研究中的長(zhǎng)者，經(jīng)典Wnt通路》和《經(jīng)典信號(hào)通路總結(jié)——Wnt信號(hào)通路》的推送中給大家介紹過著名的Wnt通路的簡(jiǎn)要情況。 2020年10月23日，荷蘭烏得勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子醫(yī)學(xué)中心的Madelon M. Maurice在《Nature Reviews Cancer》發(fā)表了題為《Mutations and mechanisms of WNT pathway tumour suppressors in cancer》的綜述長(zhǎng)文，詳細(xì)闡述了 Wnt通路相關(guān)機(jī)制在腫瘤中的角色，對(duì)于研究腫瘤的同學(xué)來說，不可不讀。 長(zhǎng)長(zhǎng)的英文難看懂，本工就把它翻譯成了中文，祝大家收獲滿滿！ Madelon是WNT通路領(lǐng)域的大佬級(jí)人物，主要致力于研究生物化學(xué)信號(hào)如何從細(xì)胞外部傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，以及WNT通路的突變?nèi)绾螌?dǎo)致細(xì)胞與環(huán)境之間的miscommunication。 下面將由本工和大家一起學(xué)習(xí)這篇重磅綜述文章 1 摘要 突變誘導(dǎo)的WNT-β-catenin信號(hào)激活在腫瘤中是一個(gè)頻繁發(fā)生的驅(qū)動(dòng)事件。WNT-β-catenin通路的持續(xù)激活使癌細(xì)胞具有持續(xù)自我更新和生長(zhǎng)的特性，并與治療耐藥有關(guān)。 在健康的成人干細(xì)胞中，WNT通路的活性受到核心通路腫瘤抑制因子和負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子的控制。小鼠模型的基因失活實(shí)驗(yàn)明確地證明了WNT腫瘤抑制基因的功能缺失突變與腫瘤生長(zhǎng)的相關(guān)性。
2 介紹 大約40年前，第一個(gè)WNT基因被發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了WNT1是在小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)插入后驅(qū)動(dòng)小鼠乳腺腫瘤發(fā)生的基因。在接下來的20年里，WNT通路的大多數(shù)關(guān)鍵組成部分都被揭開了。同時(shí)，這些研究表明了WNT信號(hào)在控制胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)展中的重要作用。 后來的研究發(fā)現(xiàn)，WNT信號(hào)是腸道、肝臟、皮膚和許多其他器官中成年干細(xì)胞自我更新和指引細(xì)胞命運(yùn)的主要驅(qū)動(dòng)力。在組織的動(dòng)態(tài)平衡過程中，WNT通路的活性受到多種腫瘤抑制因子的嚴(yán)格控制，這些抑制因子要么作為核心成分發(fā)揮作用，要么起負(fù)反饋?zhàn)饔谩?/span>WNT腫瘤抑制基因的突變或沉默已被確定可在多種癌癥類型中頻繁發(fā)生。 與這些觀察結(jié)果一致的是，WNT-β-catenin通路的持續(xù)激活被發(fā)現(xiàn)可賦予癌細(xì)胞自我更新的生長(zhǎng)特性，而且與治療耐藥性有關(guān)。 大規(guī)模的測(cè)序結(jié)果已經(jīng)清楚地表明，癌癥中的遺傳改變有著高度多樣化和復(fù)雜的特點(diǎn)。雖然癌基因的突變經(jīng)常表現(xiàn)為可導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度活躍（overactivity）的突變熱點(diǎn)，但腫瘤抑制基因的突變通常包括散布在整個(gè)基因長(zhǎng)度上的缺失和錯(cuò)義突變、無義突變和移碼突變，從而使得突變后的功能解釋變得復(fù)雜。 因此，這些觀察到的結(jié)果對(duì)我們提出了一個(gè)挑戰(zhàn)，即明確區(qū)分passenger突變和driver突變，并預(yù)測(cè)這些突變是否具有以及如何產(chǎn)生可被癌癥治療策略利用的脆弱性。 此外，靶向單個(gè)通路的突變可能會(huì)表現(xiàn)出明顯的組織或癌癥亞型的特異性，或者與在同一腫瘤中那些可解除對(duì)替代信號(hào)通路管控的突變表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步增加了機(jī)制的復(fù)雜性，并阻礙了對(duì)遺傳改變?nèi)绾未龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的理解。 這篇綜述重點(diǎn)關(guān)注了WNT通路腫瘤抑制基因各種類型的突變?nèi)绾未龠M(jìn)腫瘤發(fā)展的最新進(jìn)展。概述了不同的WNT通路突變?nèi)绾闻c組織特異性和疾病臨床進(jìn)展相聯(lián)系。我們討論了功能喪失(loss-of-function，LOF)（基因上的突變可導(dǎo)致部分/完全性的基因失活）突變?cè)谂R床前模型和人類患者中的結(jié)局，并描述了對(duì)其他類型的衍生突變的研究，及其所揭示的WNT通路腫瘤抑制基因突變驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的新機(jī)制。 最后，我們強(qiáng)調(diào)需要更全面地理解WNT通路誘變事件（mutagenic events）驅(qū)動(dòng)癌變的共同原理，以改進(jìn)精準(zhǔn)癌癥藥物的應(yīng)用和設(shè)計(jì)更有效的治療方法。 3 WNT-β-catenin信號(hào) WNT介導(dǎo)的受體激活可以沿著不同的通路傳遞信號(hào)，這些通路大致可分為β-catenin依賴和β-catenin非依賴的信號(hào)通路。 在此，我們將重點(diǎn)放在與癌癥發(fā)生密切相關(guān)的β-catenin依賴的通路上。這個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一個(gè)中心事件是：轉(zhuǎn)錄共激活因子β-catenin的調(diào)節(jié)蛋白水解性周轉(zhuǎn)（proteolytic turnover）。
這個(gè)蛋白復(fù)合物捕獲并磷酸化β-catenin，然后被E3連接酶SKP1-CUL1-F-box protein (SCF)–β-transducin repeat-containing protein (β-TrCP)泛素化，并被分派到蛋白酶體完成其降解(圖1A)。 WNT介導(dǎo)的細(xì)胞刺激是由WNT與其受體Frizzled(FZD)和LRP5或LRP6在細(xì)胞表面形成的三聚體復(fù)合物啟動(dòng)的。受體激活介導(dǎo)效應(yīng)蛋白Dishevelled (DVL)的募集，進(jìn)而將AXIN1和其他核心破壞復(fù)合物組分募集到質(zhì)膜上。 總之，這些事件阻止了破壞復(fù)合物介導(dǎo)的β-catenin的降解，使其積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合因子 (TCF/LEF)家族結(jié)合，并驅(qū)動(dòng)WNT靶基因的轉(zhuǎn)錄(圖1A)。 為了防止過度的信號(hào)水平，WNT誘導(dǎo)的反應(yīng)通常會(huì)有許多負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子來平衡。WNT靶基因AXIN2(也稱為傳導(dǎo)素)，其RNA產(chǎn)物通常被用作WNT通路活性的標(biāo)志，有助于提高胞漿中破壞復(fù)合物的活性，并下調(diào)β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 此外，膜結(jié)合的E3連接酶RNF43（環(huán)指蛋白）和ZNRF39（鋅和環(huán)指蛋白）的誘導(dǎo)表達(dá)介導(dǎo)了WNT受體的泛素化，從而驅(qū)動(dòng)了WNT受體的內(nèi)化和溶酶體的降解，從而降低了細(xì)胞對(duì)WNTs的敏感性。 此外，最近發(fā)現(xiàn)RNF43可發(fā)揮二級(jí)抑制作用，即通過促進(jìn)破壞復(fù)合物的活性來阻止β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，該機(jī)制尚未完全了解，但涉及到了RNF43胞漿尾巴與CK1的調(diào)節(jié)相互作用(圖1B)。 然而，在成體干細(xì)胞的生態(tài)位中（niche），RNF43和ZNRF3的負(fù)反饋可被R-響應(yīng)素(R-spondin, RSPO)家族的分泌蛋白局部抵消。通過與富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)家族成員和RNF43或ZNRF3形成復(fù)合物，RSPO促進(jìn)RNF43和ZNRF3從細(xì)胞表面清除(圖1B)。 此外，RSPO家族成員的一個(gè)子集通過涉及與HSPG結(jié)合的LGR非依賴機(jī)制促進(jìn)RNF43和ZNRF3的清除。因此，RSPO活性可使WNT受體聚集在細(xì)胞表面，并誘導(dǎo)干細(xì)胞維持所需的、由高水平β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 4 WNT抑癌基因突變 4.1 β-catenin激活的驅(qū)動(dòng)途徑 WNT通路腫瘤抑制基因突變的主要結(jié)果是產(chǎn)生不必要的β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，它激活了促進(jìn)干性（stemness）、增殖和存活的基因程序。過高的β-catenin活性可以通過兩條主要的突變驅(qū)動(dòng)途徑來實(shí)現(xiàn)。 β-catenin破壞復(fù)合物的突變是腫瘤中WNT通路激活的典型模式，例如APC、AXIN1和AXIN2的失活突變或β-catenin（由CTNNB1編碼）本身的激活突變（activating mutations）。 這些事件通常被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)WNT非依賴性腫瘤生長(zhǎng)的一種狀態(tài)(圖1C)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，WNT受體豐度的失調(diào)是致癌的第二條途徑。這種致癌途徑是由RNF43和ZNRF3的缺失啟動(dòng)的，從而消除了正常情況下驅(qū)動(dòng)成體干細(xì)胞（adult stem cells）中WNT受體內(nèi)吞的負(fù)反饋回路。 值得注意的是，RNF43和ZNRF3缺失的細(xì)胞已經(jīng)失去了對(duì)RSPO的需求，從而顯示出一種腫瘤細(xì)胞的特征——生態(tài)位非依賴（niche independency）的生長(zhǎng)。
4.2 組織特異性 雖然WNT通路的基因改變發(fā)生在大多數(shù)癌癥類型中，但個(gè)別WNT信號(hào)成分的突變顯示出相當(dāng)程度的組織特異性。對(duì)TCGA的33種癌癥類型中單個(gè)WNT通路成分的突變頻率進(jìn)行研究，結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌、皮膚癌和胃癌中會(huì)發(fā)生各種核心成分的突變，而其他癌癥類型的選擇性更高(圖2A)。 在結(jié)直腸癌中，散發(fā)性腫瘤中積累的APC突變比例最大(67%)，其次是比例較低的RNF43(8%)、CTNNB1(6%)和AXIN2(5%)。相反，肝癌會(huì)優(yōu)先發(fā)生CTNNB1(25%)和AXIN1(8%)突變，而胰腺癌傾向于RNF43(6%)的突變，腎上腺皮質(zhì)癌與ZNRF3(20%)或CTNNB1(15%)突變有關(guān)。 值得注意的是，WNT通路突變對(duì)癌癥發(fā)展的貢獻(xiàn)可能比TCGA數(shù)據(jù)庫中反映的要大。例如，由于移碼突變的calling不完全,已鑒定的RNF43突變數(shù)量似乎不足。 此外，WNT通路調(diào)節(jié)因子可能因?yàn)閱?dòng)子被超甲基化而下調(diào)，例如如AXIN1會(huì)在很大一部分非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)(43%，29/67)，以及ZNRF3可在BRAF突變的大腸癌中的表達(dá)(72%，36/50)。 4.3 腫瘤亞型與預(yù)后 雖然WNT抑癌基因突變都集中在增強(qiáng)β-catenin活性上，但新出現(xiàn)的證據(jù)表明，WNT通路不同突變的功能后果并不相同。大規(guī)模的癌癥基因組圖譜顯示，WNT通路成分的特定突變可能發(fā)生在癌癥發(fā)展的早期或晚期，與特殊的癌癥亞型相關(guān)，并與臨床預(yù)后有著不同的相關(guān)性。下面,我們討論對(duì)兩種主要癌癥類型的最新見解。 4.4 結(jié)直腸癌 APC基因作為把關(guān)基因（gatekeeper gene）的突出作用是在1991年由多個(gè)研究小組首次發(fā)現(xiàn)的，他們共同證明了APC基因的失活會(huì)導(dǎo)致家族性腺瘤性息肉病(FAP)，這是一種以廣泛性腸道息肉形成為特征的綜合征，具有發(fā)展為大腸癌的高度風(fēng)險(xiǎn)。 在散發(fā)性腫瘤中同時(shí)鑒定出大量的APC突變則證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)(圖2A)。不同發(fā)展階段腫瘤病變的分子特征表明，APC突變發(fā)生在早期，且可能是限速事件。 然而，最近的研究表明，先前存在的致癌性KRAS突變，通常在老化的人類結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)，這可能標(biāo)志著APC突變的首選起始位點(diǎn)。顯然，KRAS、TP53、SMAD4和/或PIK3CA的驅(qū)動(dòng)突變與APC突變協(xié)同推動(dòng)腺瘤向癌的逐步發(fā)展。 除了WNT、表皮生長(zhǎng)因子、TGF-β或PI3K信號(hào)通路的改變提供選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)外，這些癌細(xì)胞還具有染色體不穩(wěn)定性(CIN)的特征。雖然這一常規(guī)的突變事件序列解釋了相當(dāng)大一部分大腸癌的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，但隨著癌癥基因組測(cè)序的進(jìn)展，更多的突變基因被揭示出來，從而揭示了大腸癌的異質(zhì)性。 通過大規(guī)模測(cè)序發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌(n?=?3,962)患者被細(xì)分為四個(gè)共同的分子亞型(CMS)，每個(gè)亞型都具有不同的生物學(xué)特征：CMS1(14%)，伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和免疫激活的高度突變亞群；CMS2(37%)，具有明顯的WNT和MYC活性的典型上皮亞群；CMS3(13%)，明顯代謝紊亂的上皮亞群；和CMS4(23%)，表現(xiàn)為顯著的TGF-β激活。 值得注意的是，結(jié)直腸癌中的WNT通路突變分離到了不同的CMS(圖2B)。雖然APC突變?cè)贑MS2中廣泛存在，并與CIN一致，但RNF43和ZNRF3突變以及RSPO家族成員基因融合在MSI連鎖的高突變CMS1亞組腫瘤中被發(fā)現(xiàn)顯著富集。因此，WNT通路突變的類型與腫瘤的生物學(xué)背景之間存在關(guān)系。 特別是，RNF43突變和ZNRF3突變與大腸癌發(fā)展的鋸齒狀途徑（serrated pathway）有關(guān)，而鋸齒狀息肉起源于富含激活BRAF突變和錯(cuò)配修復(fù)(MMR)基因突變的癌前鋸齒狀息肉。與APC突變相反，RNF43突變的獲得被認(rèn)為是推動(dòng)腺瘤向癌癥發(fā)展的晚期事件。 值得注意的是，與抗癌基因突變的腫瘤不同，BRAF突變的微衛(wèi)星相關(guān)腫瘤不表現(xiàn)出顯著的核β-catenin積聚。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，與APC突變相比，RNF43突變通常與WNT通路激活水平較低有關(guān)。 最近的研究表明，RNF43突變?cè)谟〗浼?xì)胞癌中也很豐富，印戒細(xì)胞癌是一種罕見的早發(fā)性大腸癌，表現(xiàn)出侵襲性行為，并與不良預(yù)后相關(guān)。與APC突變型腫瘤不同的是，這些印戒細(xì)胞腫瘤不表現(xiàn)出明顯的EGF或PI3K通路的激活，常規(guī)WNT靶基因的僅表現(xiàn)為低表達(dá)水平，這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了不同的致病機(jī)制。 引人關(guān)注的是，APC和RNF43突變也與結(jié)腸內(nèi)不同的原發(fā)腫瘤位置相關(guān)。APC突變主要見于左側(cè)大腸癌，而RNF43突變主要見于右側(cè)大腸癌。與上述RNF43突變特征相一致的是，右側(cè)腫瘤通常含有BRAF突變，并顯示MSI連鎖的超突變（hypermutation）。 然而，即使校正了MSI狀態(tài)，RNF43突變也與右側(cè)大腸癌相關(guān)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持了WNT通路改變的區(qū)域性（regional）偏好。這種偏好的分子基礎(chǔ)尚不清楚，可能的原因是左右側(cè)大腸對(duì)致癌性WNT信號(hào)水平的要求不同，而在左側(cè)大腸癌中，WNT信號(hào)水平通常更高。 事實(shí)上，生理性的WNT信號(hào)水平在健康的腸道也表現(xiàn)出區(qū)域差異，這可能與成人結(jié)腸的發(fā)育過程有關(guān)，左側(cè)和右側(cè)區(qū)域分別來自胚胎后腸和中腸。重要的是，原發(fā)腫瘤的不同部位與預(yù)后不同相關(guān)。左側(cè)腫瘤大多轉(zhuǎn)移到肝臟和肺，切除和化療是潛在的治療方法，而右側(cè)腫瘤會(huì)導(dǎo)致腹膜轉(zhuǎn)移，仍然難以治療，預(yù)后較差。 總之，APC和RNF43中的驅(qū)動(dòng)突變代表了具有不同特征的CRC子集。表1概述了APC突變型和RNF43突變型CRC亞集的生物學(xué)和分子特征。 4.5 肝細(xì)胞癌 肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第六大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。肝細(xì)胞癌約占肝癌患者的90%，其特點(diǎn)是WNT-β-catenin信號(hào)經(jīng)常過度激活。肝細(xì)胞癌中WNT通路最顯著的基因改變包括CTNNB1的激活突變(28-40%)和AXIN1的LOF突變(11%)。 與其腫瘤抑制作用相一致的是，AXIN1突變經(jīng)常與雜合性缺失(LOH)相關(guān)。由于很大一部分人肝細(xì)胞是多倍體的，這可能會(huì)保護(hù)這些細(xì)胞免受抑癌基因丟失的影響，因此很容易推測(cè)AXIN1突變可能是在二倍體狀態(tài)下獲得的。 與大腸癌的APC突變相反，CTNNB1和AXIN1突變通常不出現(xiàn)在肝臟的癌前病變中，而是與腫瘤發(fā)展的后期有關(guān)。一致的是，WNT通路的激活只有在HCC的晚期才明顯，因此被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的晚期步驟。 值得注意的是，CTNNB1和AXIN1突變與不同的肝癌亞型相關(guān)，表現(xiàn)出不同的臨床和病理特征。CTNNB1突變直接介導(dǎo)β-catenin的穩(wěn)定和核積聚，與“非增殖性”肝癌相關(guān)，包括染色體穩(wěn)定的腫瘤，表現(xiàn)出分化的標(biāo)志，并傾向于保留肝細(xì)胞樣標(biāo)志。 這些腫瘤表現(xiàn)出典型的WNT激活基因表達(dá)特征，通常與較好的預(yù)后相關(guān)。相比之下，AXIN1突變僅限于臨床侵襲性肝癌，這類“增殖性”腫瘤的特點(diǎn)是分化差、細(xì)胞周期標(biāo)記物和CIN過度表達(dá)。此外，與CTNNB1突變相比，AXIN1突變的HCC腫瘤表現(xiàn)出不同轉(zhuǎn)錄程序的激活。 綜上所述，雖然CTNNB1和AXIN1的突變?cè)谝种痞?catenin更新/周轉(zhuǎn)（turnover）方面的作用是一致的，但它們?cè)诟伟┌l(fā)生中的作用明顯不同。這種差異的分子基礎(chǔ)仍未解決。 5 突變的分子機(jī)制 在傳統(tǒng)的觀點(diǎn)中，突變誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因的雙等位基因失活會(huì)導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生存和增殖的信號(hào)通路發(fā)生不適當(dāng)激活。因此，通常采用基因敲除的方法來研究腫瘤抑制因子的作用。 然而，隨著人類癌癥基因組測(cè)序的進(jìn)步，出現(xiàn)了一幅復(fù)雜得多的圖景。抑癌基因的突變是高度異質(zhì)性的，導(dǎo)致了一系列活性未知的錯(cuò)誤蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)沒有被基因敲除模型很好地捕捉到（captured）。 此外，這種異質(zhì)性給明確區(qū)分passenger突變和driver突變以及理解潛在的致癌機(jī)制帶來了挑戰(zhàn)。此外，除了喪失生長(zhǎng)抑制能力外，突變的抑癌基因還可能獲得促進(jìn)腫瘤發(fā)生的新功能。 在這里，我們討論了在癌癥中，關(guān)于病人來源的突變?nèi)绾胃淖僕NT通路腫瘤抑制功能的最新見解和發(fā)現(xiàn)。 5.1 “破壞復(fù)合物”的突變 5.1.1 大腸癌中的APC截?cái)嗤蛔儺a(chǎn)生“恰到好處”WNT信號(hào)水平 APC的腫瘤抑制活性主要依賴于它與β-catenin和AXIN的相互作用，這些作用是通過位于其內(nèi)在無序區(qū)的羧基末端中間的多個(gè)短重復(fù)序列來實(shí)現(xiàn)的(方框1)。 雖然大腸癌通常攜帶雙等位APC突變，但APC功能通常不會(huì)完全失活。在絕大多數(shù)情況下，基因的5’端受到無義或移碼突變的打擊，這些突變介導(dǎo)了過早截?cái)嗟腁PC蛋白變體的表達(dá)(圖2C)。 值得注意的是，影響兩個(gè)APC等位基因的突變是相互依賴的（interdependent）。在FAP患者中，胚系突變導(dǎo)致去除了所有β-catenin結(jié)合的20個(gè)氨基酸重復(fù)(20R)，緊隨其后的是保留至少一個(gè)20R的體細(xì)胞二次突變。相反，當(dāng)生殖系變異保留一個(gè)或多個(gè)20R時(shí)，第二次打擊將失去所有20R，要么是上游截?cái)?，要么是等位基因丟失。 這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了“恰到好處”的信號(hào)模型，在該模型中，兩個(gè)APC等位基因都被選擇來保持足夠的β-catenin調(diào)節(jié)活性，以產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)的最佳信號(hào)窗口。與這一假設(shè)一致的是，由于蛋白質(zhì)的遞增縮短而導(dǎo)致的APC調(diào)控重復(fù)序列的漸進(jìn)性丟失可對(duì)應(yīng)于小鼠胚胎干細(xì)胞、人類CRC細(xì)胞和果蠅胚胎中WNT信號(hào)的逐步增強(qiáng)。 各種證據(jù)表明，在密碼子從1286到1581的“突變簇區(qū)”(mutation cluster region，MCR)內(nèi)，截短的APC變體最適合產(chǎn)生對(duì)腫瘤生長(zhǎng)最有利的特定水平的WNT信號(hào)。在FAP患者中，單等位或雙等位APC MCR截短與最嚴(yán)重的息肉病相關(guān)，而截?cái)嗤蛔兿虬被┒嘶駽末端移動(dòng)對(duì)應(yīng)著較弱的疾病程度。 此外，在散發(fā)性大腸癌中，76%的APC突變病例攜帶至少一個(gè)包含MCR截短的等位基因。 最后，臨床前的FAP小鼠模型還顯示，最嚴(yán)重的腸息肉發(fā)生在攜帶Apc 1322T/+雜合子MCR截短的小鼠中，其次是常用的APC多發(fā)性腸道腫瘤(Apc Min/+)小鼠，其形式較短，在密碼子850處截短。在1572或1638密碼子上觀察到了更長(zhǎng)的、亞效等位（hypomorphic，是指只失去了部分的基因功能）APC截?cái)?，保留了更多的?catenin調(diào)節(jié)域(圖3A)。 值得注意的是，在這些小鼠模型中，息肉主要發(fā)生在小腸，而在FAP和散發(fā)性大腸癌患者中，大腸是息肉形成的首選部位。這種差異的分子基礎(chǔ)仍有待解決，但可能與人和小鼠腸道之間生理性WNT信號(hào)梯度的差異有關(guān)。 MCR區(qū)截短的APC的哪些分子特征可以實(shí)現(xiàn)特定水平的β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄？首先，丟失所有三個(gè)AXIN蛋白結(jié)合的絲氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-脯氨酸Ser-Ala-Met-Pro（SAMP）重復(fù)序列似乎是β-catenin破壞復(fù)合物失活的關(guān)鍵決定因素。盡管缺少這些常規(guī)的AXIN蛋白結(jié)合位點(diǎn)，SAMP缺失的APC截?cái)囿w仍然與AXIN形成復(fù)合物，這可能是通過使用位于Armadillo重復(fù)(ARM)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的替代結(jié)合位點(diǎn)(方框1)。 第二個(gè)條件是通過組合的雙等位APC截?cái)?，保留最多三個(gè)β-catenin結(jié)合的20R。雖然剩下的這些20R仍然促進(jìn)β-catenin的磷酸化，但它們并不促進(jìn)在缺乏APC的細(xì)胞中β-catenin的破壞（destruction）。相反，這些20R被認(rèn)為是通過介導(dǎo)保留細(xì)胞質(zhì)的β-catenin而賦予剩余的調(diào)節(jié)活性。 最后，如腸道類器官所示，失去與第二個(gè)20R(20R2)相鄰的保守的catenin抑制域(CID；或“sequence B”)(方框1)是驅(qū)動(dòng)WNT通路活性高基礎(chǔ)水平的額外要求。潛在的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究，但似乎涉及與α-catenin相互作用的喪失，這一喪失阻止了APC與磷酸化的β-catenin的穩(wěn)定相互作用。 此外，缺失CID的APC與E3連接酶β-TrCP的結(jié)合減弱可能進(jìn)一步阻礙β-catenin的泛素化和蛋白水解。 此外，CID的缺失（removal）可能會(huì)促進(jìn)泛素特異性加工蛋白酶7(USP7)的募集，從而通過去泛素化進(jìn)一步提高β-catenin的穩(wěn)定性。因此，MCR-截短的APC平衡了β-catenin降解的損失和剩余的調(diào)節(jié)活性，以產(chǎn)生最佳β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄量來驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)。 5.1.2不太流行（less prevalent）的截?cái)郃PC形式的相關(guān)事件 MCR下游的APC截短對(duì)WNT信號(hào)的影響較小，在人類癌癥中發(fā)生的頻率較低，研究也較少。然而，有幾條證據(jù)表明，這些變異也起到了致瘤驅(qū)動(dòng)作用。小鼠表達(dá)在CID后截短的亞效等位APC后表現(xiàn)出較輕的腸息肉，但卻獲得了腸外組織中的多個(gè)腫瘤(例如，在乳房、肝臟和骨骼中)(圖3A)。 一致的是，TCGA數(shù)據(jù)庫中保留CID的APC截短體的比例在大腸癌中最低（約占557例APC突變病例的10%），但在其他惡性腫瘤中卻有所增加，如胃腺癌(33例中的40%)和子宮內(nèi)膜樣癌(58例中的40%)，這表明這些癌癥類型可能有著（select）較低的WNT信號(hào)水平(圖3B，C)。 值得注意的是，突變體APC的剩余抑制活性是濃度依賴性的，并可能受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化的進(jìn)一步調(diào)節(jié)。與此相一致的是，部分性地降低APC蛋白水平可以使結(jié)腸細(xì)胞對(duì)WNT刺激敏感。 此外，與其他途徑的驅(qū)動(dòng)突變之間的協(xié)同作用可能會(huì)改變WNT的劑量效應(yīng)和組織偏好，就比如，亞效等位Apc 1572T小鼠在導(dǎo)入Smad4突變后可獲得顯著的腸息肉表型。 最后，值得注意的是，APC突變可能會(huì)激活癌癥中的其他驅(qū)動(dòng)途徑，如Hippo–Yes-相關(guān)蛋白(YAP)信號(hào)和CIN。雖然這些事件超出了本綜述的范圍，但它們顯然將促進(jìn)APC突變驅(qū)動(dòng)的癌癥發(fā)展。 5.1.3 APC2活性在APC突變腫瘤中的角色 APC突變所導(dǎo)致的嚴(yán)重性可由其功能同源物APC2的表達(dá)來平衡，APC2有著與APC相似的結(jié)構(gòu)，但缺少與β-catenin結(jié)合的15個(gè)氨基酸重復(fù)(15R)區(qū)域(方框1)。雖然APC2本身具有弱的β-catenin下調(diào)活性，但它的效率可通過與APC的異源二聚作用而提高。 事實(shí)上，APC2與MCR截短的APC結(jié)合可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin降解的殘留水平。雖然這種活性不能完全補(bǔ)償APC功能的喪失，但很大一部分(43-95%，29/66和97/102)的大腸癌表現(xiàn)出APC2啟動(dòng)子的超甲基化，這表明由于APC2表達(dá)缺失而獲得的較高水平的β-catenin活性可能為腫瘤提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。 WNT通路的APC2依賴調(diào)控表現(xiàn)出組織特異性。例如，小鼠乳腺上皮中缺失Apc或Apc2并不會(huì)影響組織穩(wěn)態(tài)，而同時(shí)缺失Apc和Apc2會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定的β-catenin水平過高，從而導(dǎo)致乳腺腫瘤的形成。因此，與結(jié)腸相比，APC2似乎可以補(bǔ)償乳腺組織中APC的丟失。因此，APC2在其他組織中的表達(dá)是否以及如何平衡WNT信號(hào)閾值需要我們進(jìn)一步研究。 5.1.4 AXIN1功能缺失的后果 所有癌癥類型的突變譜顯示，24%(57/240)的病例發(fā)生AXIN1深度刪失(圖2C)。由于AXIN1在破壞復(fù)合物組裝中的關(guān)鍵組織作用(方框1)，我們?cè)O(shè)想AXIN1的缺失將誘導(dǎo)細(xì)胞中非依賴于WNT的β-catenin激活。 事實(shí)上，Axin刪失與線蟲和果蠅中明顯的WNT介導(dǎo)的表型相一致，并誘導(dǎo)小鼠胚胎死亡。 為了研究AXIN1缺失在體細(xì)胞中的潛在癌癥驅(qū)動(dòng)作用，鑒于AXIN1突變?cè)诟伟┲械钠毡榇嬖?，我們建立了條件干擾Axin1表達(dá)的小鼠模型來評(píng)估AXIN1突變對(duì)肝臟動(dòng)態(tài)平衡的影響。 足齡（adult）鼠肝臟中Axin1的缺失可導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖量急劇增加，在12?月大時(shí)，40-55%(27/67和5/9)的小鼠出現(xiàn)了組織學(xué)上類似于人類肝癌的肝癌。與Apc缺失或激活Ctnnb1突變相反，Axin1缺失的肝細(xì)胞和腫瘤中常規(guī)WNT靶基因的表達(dá)沒有或僅有微弱的增加。 然而，Axin1缺失誘導(dǎo)的基因特征與通常發(fā)現(xiàn)AXIN1突變的預(yù)后不良的“增殖性”肝細(xì)胞癌亞類有很大的相似之處。特征性的特點(diǎn)包括Notch和YAP信號(hào)水平的增強(qiáng)以及對(duì)胎兒基因表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。 對(duì)在其他細(xì)胞類型和組織中AXIN1缺失的后果的評(píng)估依然有限。在WNT和RSPO停用（withdrawal）條件下，對(duì)人小腸類器官進(jìn)行CRISPR基因敲除篩選可促進(jìn)APC或AXIN1刪失的類器官發(fā)生選擇性生長(zhǎng)。 此外，長(zhǎng)期用有效的WNT分泌抑制劑處理WNT超敏、RSPO3過表達(dá)的CRC株，可誘導(dǎo)獲得AXIN1雙等位基因移碼缺失的抗性克隆的生長(zhǎng)。因此，這些結(jié)果證實(shí)了AXIN1的缺失介導(dǎo)了腸道器官中WNT信號(hào)水平的增加。此外，負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子AXIN2的誘導(dǎo)顯然不足以抵消這些細(xì)胞中WNT信號(hào)的整體增加。 最后，雖然AXIN1突變只在一小部分大腸癌中被檢測(cè)到(3%，19/549)，但AXIN1的缺失可能通過其他機(jī)制發(fā)生。例如，E3泛素連接酶RNF146的轉(zhuǎn)錄上調(diào)后，可通過泛素化介導(dǎo)的AXIN1降解和β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活來促進(jìn)大腸癌的增殖和存活。RNF146在6%(13/205)的大腸癌病例中存在過表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)。 類似地，RNF146過表達(dá)可通過增強(qiáng)WNT-β-catenin信號(hào)在很大一部分NSCLC中促進(jìn)增殖和侵襲。由于RNF146能夠降解兩個(gè)AXIN類似物，這種E3連接酶的上調(diào)可能比AXIN1或AXIN2的單個(gè)突變更有效。 5.1.5 AXIN2突變的后果 盡管AXIN2介導(dǎo)的負(fù)反饋似乎不足以完全補(bǔ)償AXIN1的丟失，AXIN2的體細(xì)胞突變?cè)诟鞣N癌癥類型中還是很普遍的(圖2A)。此外，人類AXIN2生殖系突變與肺癌、乳腺癌和大腸癌的易感性有關(guān)。對(duì)AXIN2變異體驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生的作用模式的評(píng)估也仍然有限。 例如，一個(gè)反復(fù)（recurring）截短的AXIN2突變體在細(xì)胞系中異位表達(dá)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出部分的功能缺失。鑒于AXIN2突變與其他WNT通路突變?cè)诎┌Y中普遍共存，AXIN2 LOF所導(dǎo)致的微弱通路活性可能與這些突變協(xié)同作用，提高信號(hào)水平或產(chǎn)生耐藥性。進(jìn)一步研究AXIN2突變的分子機(jī)制以及它們與其他基因改變的協(xié)同性，才能更好地理解這些突變?nèi)绾未龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 5.1.6 AXIN1 錯(cuò)義突變的機(jī)制：不止是功能缺失 盡管通過對(duì)AXIN1缺失的研究獲得了不少有用的信息，但人類癌癥中，發(fā)生在AXIN1上最多的基因改變形式是錯(cuò)義突變(圖2C)，而這些錯(cuò)義突變散布在整個(gè)基因長(zhǎng)度上，使得對(duì)它們的功能預(yù)測(cè)變得復(fù)雜。 最近，對(duì)發(fā)生在N端RGS結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變進(jìn)行深入地分析結(jié)果顯示，突變的AXIN1蛋白可能獲得驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)的新功能特性(方框1)。從機(jī)制上講，錯(cuò)義驅(qū)動(dòng)突變被發(fā)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)上破壞了RGS結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定，并介導(dǎo)了小規(guī)模聚集體的形成，這些聚集體重新連接了AXIN1的相互作用關(guān)系（AXIN1 interactome），以促進(jìn)基礎(chǔ)WNT通路的激活(圖4)。 此外，在AXIN1的內(nèi)源性位點(diǎn)上，RGS區(qū)域錯(cuò)義突變的插入促進(jìn)了果蠅體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，證實(shí)了其癌癥驅(qū)動(dòng)因子的活性。通過引入抑制聚集（aggregation）和挽救致瘤效應(yīng)（rescued tumorigenic effects）的次級(jí)突變（secondary mutations），驗(yàn)證了聚集作為潛在機(jī)制的作用。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明抑癌基因的錯(cuò)義突變可能通過不可預(yù)見的機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。 然而，大多數(shù)其他錯(cuò)義突變的關(guān)聯(lián)性仍不清楚。鑒于AXIN1作為中樞蛋白（hub protein）的作用以及其自我聚合的能力，可以預(yù)見突變對(duì)這些功能的多種干擾模式。機(jī)械論式的觀察（mechanistic insight）將有助于根據(jù)它們的作用模式對(duì)大量已報(bào)道的突變進(jìn)行分類。此外，由于破壞復(fù)合物的活性取決于APC和AXIN1蛋白的絕對(duì)水平和比例，因此在內(nèi)源性水平上評(píng)估突變的AXIN1對(duì)分子和細(xì)胞的影響有著至關(guān)重要的作用。 5.2 WNT受體調(diào)節(jié)基因的突變 5.2.1 RNF43和ZNRF3的功能缺失突變 小鼠的基因缺失實(shí)驗(yàn)表明，RNF43和ZNRF3的腫瘤抑制作用在腸道中是多余的，而這兩個(gè)基因的同時(shí)失活是腫瘤生長(zhǎng)所必需的。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，結(jié)直腸癌中通常存在RNF43突變，并伴隨著ZNRF3的下調(diào)，這可能是由于突變或表觀遺傳機(jī)制所致。 然而，在不同的細(xì)胞和組織中模擬RNF43和ZNRF3缺失則表現(xiàn)出了背景依賴效應(yīng)（context-dependent effects），即其中一個(gè)旁系同源物（paralogues）可能比另一個(gè)占優(yōu)勢(shì)。例如，小鼠Rnf43的缺失會(huì)導(dǎo)致WNT信號(hào)不正確，并導(dǎo)致胰腺和胃的增生性生長(zhǎng)，而Znrf3的缺失則會(huì)導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)腫瘤的形成。 值得注意的是，RNF43 LOF突變的WNT超敏性結(jié)直腸癌亞群常表現(xiàn)出WNT通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子發(fā)生表觀遺傳的下調(diào)，包括AXIN2，以及NOTOM和WNT抑制因子——WIF1，它們抵消了WNT的活性。 因此，這種改變可能進(jìn)一步增強(qiáng)RNF43和ZNRF3突變細(xì)胞中WNT反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度，并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。 在人類癌癥中，RNF43的突變類型以截?cái)嗪湾e(cuò)義突變?yōu)橹?，而ZNRF3更常受到錯(cuò)義突變和缺失的影響(圖2C)。對(duì)不同RNF43突變的功能分析表明，可以通過不同的機(jī)制導(dǎo)致功能缺失(圖5A-D)。 首先，發(fā)生在RNF43的E3連接酶RING區(qū)域上游的截短突變將導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)的缺失或表達(dá)非功能蛋白(圖5B)。一個(gè)突出的例子是RNF43 R117Afs*41突變，它占大腸癌RNF43突變的8-12%(4/51和6/50)，占子宮內(nèi)膜癌RNF43突變的4%(2/58)。 第二，細(xì)胞外區(qū)域的錯(cuò)義突變，如在胰腺癌中所報(bào)道的，可以介導(dǎo)RNF43在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的滯留，進(jìn)而可能是通過錯(cuò)誤折疊和ER質(zhì)量控制介導(dǎo)其發(fā)生滯留和清除。由于它們不能到達(dá)質(zhì)膜，所以這些突變體不能下調(diào)WNT受體。 此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲的RNF43突變體可能具有明顯的負(fù)活性（negative activity），因此與發(fā)生基因缺失相比其具有更強(qiáng)的致瘤能力(圖5C)。 第三種機(jī)制包括通過無義介導(dǎo)的mRNA衰變(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)耗盡突變的RNF43，這可能是在獲得未成熟終止密碼子(premature termination codons，PTC)之后誘導(dǎo)的(圖5D)。為了證明這一發(fā)現(xiàn)，抑制NMD后穩(wěn)定了CRC細(xì)胞系中幾個(gè)截短的RNF43變異體的mRNA。 然而，NMD的作用一直存在爭(zhēng)議，特別是RNF43的G659Vfs*41熱點(diǎn)突變，該突變?cè)诮Y(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜和微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的胃癌亞群中非常普遍。由于RNF43 G659Vfs*41蛋白在過表達(dá)分析中顯示出完整的功能，NMD介導(dǎo)的mRNA耗竭被認(rèn)為是一種作用模式。 事實(shí)上，患者來源或者或基因工程的人結(jié)腸類器官中的RNF43 G659Vfs*41與失活的ZNRF3相結(jié)合后獲得了RSPO非依賴的生長(zhǎng)特性，這一結(jié)果表明了功能缺失（LOF）的效應(yīng)。此外，與NMD易感性一致，攜帶G659Vfs*的人類腫瘤中RNF43 mRNA表達(dá)水平降低。 然而這一發(fā)現(xiàn)最近受到了挑戰(zhàn)，因?yàn)橐豁?xiàng)研究發(fā)現(xiàn)RNF43 G659Vfs* 的mRNA仍可穩(wěn)定表達(dá)。此外，該突變體在大腸癌細(xì)胞系中的缺失仍然誘導(dǎo)了WNT-β-catenin信號(hào)的上調(diào)，表明該突變體導(dǎo)致的功能缺失并不完全。雖然這些差異的原因尚不清楚，但突變背景和組織特性可能起到一定作用。 5.2.2 RNF43截短突變?cè)诎┌Y中的癌基因角色 根據(jù)NMD的規(guī)則，發(fā)生在RNF43的倒數(shù)第二個(gè)外顯子中心的無義或移碼突變很有可能逃脫NMD。由于目前對(duì)RNF43的了解在很大程度上依賴于基因敲除策略，研究者們對(duì)這些截短的RNF43變體如何干擾WNT信號(hào)和腫瘤發(fā)生仍然知之甚少。 最近的一項(xiàng)研究揭示了一類截短的RNF43變體可通過與LOF不同的機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生。這些失去了胞液尾端處一半遠(yuǎn)端的RNF43突變體(圖5A)完全保留了下調(diào)WNT受體的能力，但誘導(dǎo)了WNT非依賴性的β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄(圖5E)。 C末端的缺失被發(fā)現(xiàn)干擾了RNF43的第二個(gè)抑制作用，該作用涉及結(jié)合和調(diào)節(jié)β-catenin破壞復(fù)合物的活性。特別是，激酶CK1被鑒定為一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的互作伙伴，它可對(duì)RNF43尾端進(jìn)行磷酸化修飾，促進(jìn)其在β-catenin下調(diào)中的作用(圖1B，5A)。 截?cái)嗪?，RNF43與破壞復(fù)合物的相互作用受到錯(cuò)誤調(diào)節(jié)，導(dǎo)致AXIN1和CK1被捕獲在質(zhì)膜上，同時(shí)穩(wěn)定β-catenin和靶基因轉(zhuǎn)錄(圖5E)。此外，在人類原代結(jié)腸類器官中引入RNF43截短突變后，在沒有ZNRF3突變的情況下，β-catenin介導(dǎo)的生長(zhǎng)程序仍然被激活，從而證實(shí)了它們的主要致癌活性。 與APC或RNF43 LOF突變不同，致癌的RNF43突變可導(dǎo)致衰老樣生長(zhǎng)的停滯狀態(tài)，并且它們只在TP53缺失的結(jié)腸類器官中表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，像許多傳統(tǒng)的癌基因一樣，這些截短的RNF43變異體可誘導(dǎo)致癌性的壓力，并可能代表腫瘤形成過程中的晚期事件。 事實(shí)上，攜帶致癌性RNF43突變的患者腫瘤中，其衰老相關(guān)的通路也存在突變。與LOF突變的另一個(gè)重要區(qū)別是，癌基因RNF43變異體的表達(dá)使人對(duì)基于抗WNT的治療產(chǎn)生耐藥性。因此，更好地了解患者中RNF43突變的促瘤機(jī)制將有助于病人的分類和預(yù)測(cè)治療效果。 6 精準(zhǔn)醫(yī)療的機(jī)會(huì) WNT-β-catenin在人類腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵作用引起了人們對(duì)這一通路治療靶向策略的極大興趣。甚至在攜帶APC突變的晚期腸癌小鼠中，APC表達(dá)的恢復(fù)也推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞的分化和正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，這一結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)化了人們的期望。 盡管科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多WNT通路拮抗劑和抑制性小分子，但這些藥物都沒有獲得臨床批準(zhǔn)。開發(fā)臨床靶向藥物的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是抑制癌細(xì)胞中的WNT信號(hào)，同時(shí)避免由于成人干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的改變而對(duì)健康組織產(chǎn)生靶向毒性。有關(guān)對(duì)目前正在進(jìn)行臨床評(píng)估試驗(yàn)中的WNT通路抑制劑的綜合評(píng)價(jià)，我們請(qǐng)讀者參考最近的其他綜述。 下面，我們將討論Wnt-β-catenin通路腫瘤抑制因子在癌細(xì)胞中變化的最新研究進(jìn)展，這些進(jìn)展揭示了藥物治療的局限性，促進(jìn)了對(duì)具有創(chuàng)新性治療潛力藥物的發(fā)現(xiàn)。此外，我們強(qiáng)調(diào)如何積累對(duì)患者衍生突變作用機(jī)制的理解，從而改善對(duì)應(yīng)用精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的患者進(jìn)行分層。 6.1 靶向破壞復(fù)合物活性 在癌細(xì)胞中提高β-catenin破壞復(fù)合物的活性是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗闹饕煞諥PC和AXIN的關(guān)鍵蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用元件經(jīng)常缺失。 然而，最近關(guān)于在此類功能缺失（LOF）事件之后驅(qū)動(dòng)WNT信號(hào)的最新進(jìn)展揭示了一些針對(duì)性的漏洞。在攜帶APC截短的腫瘤中觀察到，殘存的破壞復(fù)合體活性為提高癌細(xì)胞中β-catenin的周轉(zhuǎn)提供了機(jī)會(huì)。 小分子XAV939可促進(jìn)有APC突變的CRC細(xì)胞系中AXIN的穩(wěn)定，被認(rèn)為是一種有效的破壞復(fù)合物活性增強(qiáng)劑。從機(jī)制上講，XAV939可以抑制TNKS1和TNKS2（Tankyrase），從而阻止AXIN1和AXIN2的PAR化以及隨后的RNF146介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體降解。 用XAV939處理除了可以促進(jìn)AXIN的穩(wěn)定性外，還通過與AXIN1和AXIN2發(fā)生共聚來提高TNKS1和TNKS2的水平，這可能通過非催化的支架作用進(jìn)一步導(dǎo)致對(duì)WNT通路的抑制作用。 盡管有這些令人振奮的發(fā)現(xiàn)，對(duì)截短的APC長(zhǎng)度與TNKS抑制劑敏感性之間關(guān)系的后續(xù)研究還是發(fā)現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果。特別的是，攜帶APC MCR截短(保留一個(gè)或兩個(gè)20R)的細(xì)胞株在體外顯示出對(duì)TNKS抑制劑的耐藥性，而在小鼠模型中，與更短的APC截短相比，攜帶這種APC突變的腫瘤對(duì)體內(nèi)治療顯示出更高的敏感性。 潛在的原因是，這種差異可能是由于WNT通路AXIN2和APC2的負(fù)調(diào)控因子表達(dá)水平的差異，這兩個(gè)調(diào)控因子都可以被TNKS抑制劑所穩(wěn)定。或者，就像突變的KRAS所顯示的那樣，對(duì)TNKS抑制的耐藥性可能是通過與其他癌癥通路共發(fā)生的致癌因素所促進(jìn)的。 另一個(gè)令人擔(dān)憂的問題是，抑制腫瘤所必需的高劑量單藥TNKS抑制劑治療會(huì)引起腸道毒性、體重減輕和死亡。然而，較低劑量的TNKS抑制劑在聯(lián)合治療方案中的表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。 因此，闡明細(xì)胞環(huán)境如何影響TNKS抑制劑的有效性，以及它們與其他靶向藥物聯(lián)合使用的價(jià)值，對(duì)于確定治療應(yīng)用的最佳策略有著至關(guān)重要的作用。 最近還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)在APC截?cái)鄷r(shí)出現(xiàn)的潛在漏洞。APC CID結(jié)構(gòu)域發(fā)生缺失的大腸癌細(xì)胞中，USP7介導(dǎo)的β-catenin去泛素化上調(diào)被認(rèn)為是WNT信號(hào)異常的主要驅(qū)動(dòng)因素。因此，用USP7抑制劑治療可以抑制APC突變的CRC細(xì)胞系和腸道器官中WNT的激活，并抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。 然而，這些發(fā)現(xiàn)受到了最近一項(xiàng)研究的挑戰(zhàn)，在這項(xiàng)研究中，USP7抑制劑通過抑制AXIN蛋白穩(wěn)定，從而被確定為WNT-β-catenin信號(hào)的積極調(diào)節(jié)者。這些研究結(jié)果之間存在差異的分子基礎(chǔ)仍然不清楚，需要仔細(xì)比較細(xì)胞系和所使用的不同類別的USP7抑制劑。 在篩選可共同調(diào)節(jié)β-catenin和RAS蛋白穩(wěn)定性的化合物的過程中，發(fā)現(xiàn)了一種可增強(qiáng)破壞復(fù)合物活性的小分子。這種化合物稱為KYA1797，它與AXIN1 RGS結(jié)構(gòu)域結(jié)合在靠近APC結(jié)合位點(diǎn)的表面。KYA1797-AXIN1通過一種尚未完全了解的機(jī)制，增加GSK3β的活性，促進(jìn)β-catenin和RAS的降解。 根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，后續(xù)工作表明β-catenin與RAS可發(fā)生直接相互作用，而且β-catenin的降解先于GSK3β依賴的RAS降解。KYA1797通過降解RAS和β-catenin癌基因，抑制攜帶APC和KRAS突變的小鼠大腸癌的生長(zhǎng)。 6.2 靶向WNT依賴的癌癥 關(guān)于RNF43和ZNRF3突變促成了對(duì)WNT依賴的生長(zhǎng)狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)，為識(shí)別對(duì)WNT抑制劑或受體阻斷抗體治療敏感的癌癥亞群打開了可能性。 阻斷WNT自分泌和旁分泌信號(hào)的一個(gè)非常有效的方法是通過靶向Porcupine(PORCN)來抑制所有活性WNT的產(chǎn)生，PORCN是一種駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的O-?；D(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)WNT棕櫚?；?，這是WNT生物合成的關(guān)鍵步驟。 事實(shí)上，臨床前的數(shù)據(jù)顯示，PORCN抑制劑有效地抑制了WNT驅(qū)動(dòng)的攜帶工程性Rnf43和Znrf3突變的小鼠腸道腫瘤模型，以及患者來源的RNF43突變結(jié)直腸癌和胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)類器官（organoids）的生長(zhǎng)。 為了利用這一脆弱性，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)可使用RNF43突變作為PORCN抑制劑治療大腸癌和PDAC患者的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。盡管臨床前研究結(jié)果的前景被看好，但對(duì)PORCN抑制劑的不良反應(yīng)已有報(bào)道，包括骨質(zhì)丟失和關(guān)節(jié)功能障礙，這可能限制了可用于臨床的藥物劑量。 然而，最近的研究表明，PORCN抑制劑可以在較低劑量時(shí)與其他藥物通過組合策略發(fā)揮作用，以提供更好的抗腫瘤效果。特別值得注意的是，PORCN和PI3K抑制劑的雙重處理可通過抑制細(xì)胞增殖和葡萄糖代謝，有效地抑制PDAC異種移植瘤的生長(zhǎng)。 因此，評(píng)估PORCN抑制劑與其他靶向藥物的協(xié)同作用似乎是治療WNT敏感性腫瘤的一種有效策略。此外，根據(jù)最近的研究，完善RNF43突變患者的分層可以提高PORCN抑制劑的療效。要做到這一點(diǎn)，需要解決RNF43突變作為passenger或driver在分類上的差異。 此外，攜帶可促進(jìn)WNT非依賴性生長(zhǎng)的RNF43突變，或預(yù)測(cè)對(duì)PORCN抑制具有耐藥性的其他共存突變的患者，需要被排除在外。最后，在RNF43和ZNRF3表現(xiàn)出冗余（redundancy）的組織中，ZNRF3的表達(dá)狀態(tài)將有助于確認(rèn)WNT依賴（WNT- addicted）性的腫瘤。 由于PORCN抑制劑影響所有WNT介導(dǎo)的通路，人們正在開發(fā)更多的選擇性策略來減輕毒性。例如，全基因組CRISPR篩查發(fā)現(xiàn)FZD5是攜帶RNF43突變的PDAC細(xì)胞系生存所必需的主要WNT受體。一致的是，F(xiàn)ZD5抑制性抗體在體外和體內(nèi)均能阻斷RNF43突變型PDAC細(xì)胞系的生長(zhǎng)。 此外，F(xiàn)ZD5靶向抑制了RNF43突變的CRC類器官的存活，而攜帶APC突變的類器官?zèng)]有受到影響。 最后，通過單鏈抗體選擇性阻斷WNT3與LRP6受體的結(jié)合，抑制了攜帶Rnf43和Znrf3突變小鼠腸道器官的過度增殖，促進(jìn)了其終末分化。因此，通過拮抗特定受體或WNT來更有選擇性地靶向WNT信號(hào)，有望克服與PORCN抑制劑治療相關(guān)的一些限制。 最后，可靶向的WNT依賴性腫瘤的范圍可能比目前預(yù)期的更廣。出人意料的是，Vantictumab(OMP-18R5)在體外和體內(nèi)都抑制了攜帶APC突變的胃癌腫瘤組織的生長(zhǎng)。Vantictumab是幾種FZD的抑制劑，已經(jīng)在晚期胰腺癌、肺癌和乳腺癌的Ib期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了評(píng)估。 攜帶下游WNT通路突變的其他人類癌癥類型的生存在多大程度上仍然依賴WNT受體活性，這一點(diǎn)還有待研究。此外，WNT通路外的突變也可能產(chǎn)生WNT超敏性（WNT- hypersensitive）腫瘤，正如胃癌中TP53和CDH1(編碼E-cadherin)的共突變所表現(xiàn)的那樣。因此，可能有一個(gè)未被探索到的癌癥亞群可以從WNT抑制策略中受益。 7 結(jié)論和展望 了解腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制是實(shí)施精準(zhǔn)腫瘤醫(yī)學(xué)的必要步驟。盡管在細(xì)胞和生物體中使用基因刪除的方法對(duì)WNT腫瘤抑制基因失活進(jìn)行建模已經(jīng)產(chǎn)生了豐富的結(jié)果信息，但這些模型只代表了在人類癌癥基因組中已發(fā)現(xiàn)的突變譜中的有限部分(圖2C)。 此外，由于突變的分散分布以及編碼蛋白中存在較大的固有無序區(qū)域，目前對(duì)WNT通路腫瘤抑制基因驅(qū)動(dòng)突變的預(yù)測(cè)算法并不是最優(yōu)的(方框1)。 正如這篇綜述中給出的例子所說明的那樣，需要對(duì)不同類別的抑癌基因突變的功能影響進(jìn)行更全面的實(shí)驗(yàn)評(píng)估，以區(qū)分驅(qū)動(dòng)突變和乘客（passenger）突變，定義共同的機(jī)制規(guī)則，了解組織特異性，并改進(jìn)治療決策的指導(dǎo)。在基因組編輯和類器官作為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可靠模型方面的最新研究進(jìn)展，將對(duì)解決這些問題提供重要價(jià)值。 成功應(yīng)用WNT阻滯劑或受體阻滯劑的一個(gè)直接挑戰(zhàn)是對(duì)WNT敏感性癌癥亞群的可靠識(shí)別。符合條件的患者可能會(huì)根據(jù)確認(rèn)的RNF43 LOF突變和特定組織中伴隨的ZNRF3 LOF進(jìn)行分層。 此外，更全面地尋找額外的預(yù)測(cè)標(biāo)記物來表征WNT依賴的生長(zhǎng)是值得進(jìn)一步探索的，并可能有助于擴(kuò)大可靶向性治療的患者亞群。此外，需要深入分析和理解表觀遺傳沉默和負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄缺失如何促進(jìn)WNT驅(qū)動(dòng)的癌癥發(fā)展和進(jìn)展，以識(shí)別和擴(kuò)大臨床上可進(jìn)行治療的（clinically actionable）患者亞群。 同樣重要的是，需要探索對(duì)WNT阻斷或受體阻斷治療具有抗性的突變和通路。除了一組特定的截短RNF43的突變外，APC和AXIN1的下游通路突變被認(rèn)為是潛在的逃逸途徑，盡管這種影響可能取決于突變發(fā)生的位置和組織環(huán)境。使用患者來源的腫瘤類器官進(jìn)行體外藥物篩選可以加速可靠標(biāo)志物的鑒定。 最后，我們目前關(guān)注的是單個(gè)WNT腫瘤抑制基因突變的分子后果，但很明顯，突變背景、腫瘤異質(zhì)性以及與其他主要癌癥通路的相互作用都值得進(jìn)一步研究。希望通過將對(duì)分子的研究與來自早期臨床試驗(yàn)的信息相結(jié)合，將針對(duì)WNT信號(hào)的研究轉(zhuǎn)化為有效的治療方法。 
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