嘌呤霉素抑制蛋白合成的原理：

嘌呤霉素（puromycin）和氨酰-tRNA分子3'末端的結(jié)構(gòu)類似，能夠與核糖體的A位點結(jié)合，從而被添加到新合成的肽鏈中去。puromycin和核糖體的A位點結(jié)合然后摻入延伸的肽鏈之后，則無法繼續(xù)參與隨后的肽鏈延伸反應，導致蛋白質(zhì)合成的提前終止，然后釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽（如下圖紅色部分所示）。因此，向細胞中添加puromycin會抑制細胞內(nèi)所有的蛋白質(zhì)合成。

嘌呤霉素抑制蛋白合成原理（圖片來源于www.cellco.com）

含有puromycin的不成熟的多肽可以被針對puromycin的抗體識別，因此可以通過WB或者IFA檢測細胞內(nèi)總的蛋白質(zhì)合成情況，或者翻譯抑制情況。

puromycin抗體檢測蛋白翻譯抑制案例詳解：

（1）puromycin抗體WB法

如下圖所示，作者用鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）感染骨髓來源的巨噬細胞，分別于感染后的3h、6h、9h、12h和15h收樣，每次收樣前用10 ug/ml的puromycin處理20min，目的是讓puromycin摻入到新和成的多肽中去，然后就能用puromycin的抗體檢測新和成的多肽了。結(jié)果顯示，隨著感染時間延長，puromycin抗體能夠檢測到的蛋白含量逐漸降低，說明新和成的蛋白減少了，也就是證明MNV感染抑制了蛋白翻譯。

鼠諾如病毒感染抑制宿主蛋白翻譯（Svenja Fritzlar et al. 2019. mBio）

（2）puromycin抗體IFA法

puromycin的抗體除了可以做WB，也可以通過做IFA來檢測細胞蛋白翻譯抑制。作者同樣是用MNV感染，分別于感染后的6h、9h和12h固定細胞，固定前用10 ug/ml的puromycin處理30min。

如下圖所示，anti-puromycin檢測的是新和成的多肽，anti-VPg標記被MNV感染的陽性細胞。尤其是MNV感染12hpi時，MNV陽性的細胞（紅色）中puromycin的信號降低，說明MNV感染的細胞中蛋白翻譯被抑制。

鼠諾如病毒感染抑制宿主蛋白翻譯（Svenja Fritzlar et al. 2019. mBio）

puromycin抗體篩選蛋白翻譯抑制因子：

為了篩選MNV編碼的蛋白翻譯抑制因子，作者將MNV編碼的基因轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中，用10 ug/ml的puromycin處理20min，收樣WB用puromycin抗體檢測蛋白翻譯情況，結(jié)果顯示NS3能夠抑制宿主蛋白翻譯。

同樣的，將MNV編碼的基因轉(zhuǎn)染到Vero細胞中，用10 ug/ml的puromycin處理30min，然后用puromycin抗體染色檢測蛋白翻譯情況，結(jié)果顯示NS3能夠抑制宿主蛋白翻譯，因為NS3陽性細胞（紅色）中puromycin信號（綠色）是降低的。

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