這里說的穩(wěn)轉細胞系的構建是指慢病毒轉染構建的穩(wěn)轉細胞系，可以構建表達細胞系，也能構建敲降細胞系，經常有人問我什么叫穩(wěn)轉和順轉的區(qū)別。瞬轉細胞系，一般情況下能夠穩(wěn)定表達最多長一周左右，而穩(wěn)轉細胞系，只要構建成功就能穩(wěn)定表達，沒有時間限制，但是也不是肯定的，一般實驗構建的細胞系超過 10 代以后，這個細胞系就有可能不靠譜了。

接下來，咱們講講穩(wěn)轉細胞系的構建。

一般來講 shRNA 用的是 HIV 病毒，雖然已經經過處理，但是一聽這名字也覺得滲人，無論如何保護自己是在實驗室永葆青春的基礎，所以一定要保護好自己，需要生物安全柜（往里吹風最好），或者超凈臺（把風給關了 （*^__^*））。（下圖是慢病毒構建載體示意圖）

病毒來了，需要分裝，-80 保存，反復凍融影響病毒活性，一般情況系，我是將病毒分成 10 ul 一管。其次是看清你自己的病毒情況，是熒光標記（一般 GFP），還是非熒光標記 （一般標簽蛋白是過表達是 Flag，敲降是 scramble）。

元元做的是腫瘤相關實驗，所以咱們這里講的是貼壁的腫瘤細胞的穩(wěn)轉，一定注意，元元講的是普適的方法，一定要看廠家的說明書。一般先用帶有 GFP 熒光的病毒摸一下合適的病毒量。先做一下預實驗，（別人都講 MOI 值，即感染時病毒與細胞數(shù)量的比值），元元不講。

1. 慢病毒轉染前 18～24 小時，將貼壁細胞 以 1×10^5（根據(jù)細胞大小而定，一般轉染前細胞長到 40-60% 為宜）孔鋪到 24 孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數(shù)量為 2×10^5/孔左右。

2. 加入 polybrene6-8 ug/ml（這個相當是破膜劑，只有細胞膜破了，病毒才有機會進入細胞內發(fā)揮作用），設置合適的病毒濃度梯度，比如 24 孔板，設置 5 個梯度，分別加入病毒量是 0，1，2，3，4，5 ul，37 ℃ 孵育。這時候用的是無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3. 4～6 h 換液 （正常的含血清的新鮮培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)，如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染 48 小時后可見明顯熒光表達，72 小時后更加明顯。用熒光顯微鏡觀察細胞的轉染效率，一般病毒量達到一定程度之后就熒光強度就不再增加了。

4. 選擇一個合適的病毒量就可以做實驗了，如果 3ul 的時候病毒的轉染效率已經和后面的沒有區(qū)別了，在 24 孔板里，合適的病毒量就是 3ul。這時候就可以構建的穩(wěn)轉細胞系了。

5. 當你把實驗組對照組轉完病毒后 24 h 就可以進行嘌呤篩選，因為病毒轉完之后轉染效率不可能達到 100%，而慢病毒在構建的時候就含有嘌呤抗性基因，一旦轉入細胞，嘌呤抗性基因就能表達嘌呤抗性蛋白，可以抵抗嘌呤對細胞的殺傷作用。有人問了，嘌呤濃度怎么定

（一句話摸濃度，在 24 孔板里，設置不同濃度梯度，48 h 細胞全部殺死的濃度即為你要的嘌呤濃度），一般在 1 ug/ml 左右，所以設定濃度一般在 0～4 ug/ml。

1. 元元，我病毒轉染效率不高怎么辦？

答：最簡單粗暴的方法是加大病毒量，不好使，那么就得從步驟入手了第一：4～6 h 換液的時間延長，8～10 h，設置過夜試試。還有一種是 4～6 小時換液的時候用的等量的有血清新鮮培養(yǎng)基稀釋原有的無血清的培養(yǎng)基，不撤掉病毒，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

2. 元元，我著急做實驗，我不用 24 孔板，行不行，我用瓶，用平皿行不行？

答：如果你病毒量足夠的話，完全可以。那怎么換算呢，根據(jù)細胞量或者培養(yǎng)基以及底面積自己算個大概的病毒量就行。

自己換算吧，元元數(shù)學不好。

3. 元元，還有個問題是不是擴增倍數(shù)越多越好？

答：這個不是的，HIV 病毒是逆轉錄病毒，會隨機插入基因組，擴增倍數(shù)越大，說明插入基因組的數(shù)量越多，這樣基因被損壞的越多，一般文章非編碼 6～8 倍左右，編碼基因 2～4 倍即可，太多了不好。

4.元元，還有個問題......

答：今天打烊了。