之前寫過一篇培養(yǎng)細胞的文章，被我刪除了，因為部分有誤，這一次的，比較靠譜，有參考價值。

參考文獻：劉斌等，細胞培養(yǎng)，第三版。

正文

細胞復蘇

概述

復蘇細胞要快，快速解凍，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。

用品

培養(yǎng)液（復蘇細胞一般用血清濃度為20%培養(yǎng)基），吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，水浴鍋（提前預熱）。

步驟

(1)快速解凍細胞：將凍存管從液氮罐中取出，直接投入37℃溫水中，并輕輕搖動令其內(nèi)容物盡快融化。如果凍存管封閉不嚴，在保存過程中液氮進入其中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導致液氮急速氣化而爆炸，因此，必要時要做好防護：存取凍存管時都要佩戴防護眼鏡和手套，凍存管投人存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。

(2)加培養(yǎng)基+離心：從37 ℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并滴加完全培養(yǎng)液混合后低速離心，除去上清液。必要時再重復用完全培養(yǎng)液漂離心洗1次。

離心方式：800~1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3~5分鐘。

培養(yǎng)基加多少：1~10倍體積，一般加1倍，比如1毫升細胞懸液+1毫升培養(yǎng)基。

(3)重懸細胞+培養(yǎng)：用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入 CO?培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換1 次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞復蘇時細胞數(shù)可以做適當稀釋，接種細胞密度以5x10e5/mL為宜。

注意：一般先用1毫升培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞沉淀，吹打均勻，再加剩余的培養(yǎng)基放入溫箱。

細胞換液

物品：移液槍，吸管，PBS（必要時），培養(yǎng)基。

步驟：1.吸出舊的培養(yǎng)基；2.必要時PBS洗2~3次；3.加入新的培養(yǎng)基。

時機：營養(yǎng)液變黃（酸性代謝產(chǎn)物增多，PH下降，營養(yǎng)液快消耗完了，營養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)榈S色）；一般2~3天換液1次，生長緩慢的細胞3~4天換一次，沒有統(tǒng)一的標準。

細胞傳代

原因：細胞長滿培養(yǎng)瓶，不傳代的話，就會死。

1.判斷死活：把培養(yǎng)小罐拿出來，顯微鏡偷窺，細胞死了就可以下班了。圓形的細胞，一般就是死球了；張牙舞爪的才是活的。

2.丟棄原培養(yǎng)基：吸走原來的培養(yǎng)基（沒有營養(yǎng)了，只有代謝廢物，就是細胞的尿液和屁）。

3.PBS大清洗：沖洗2次左右，把原來培養(yǎng)基的殘余勢力給全部清除，另外，培養(yǎng)基會降低胰酶的功力。

4.裂開細胞：0.05%trypsin大約1ml，裂開細胞，棒打鴛鴦，讓抱團取暖的、躺平粘在瓶底的細胞離別成單個光棍細胞。37度溫箱，1.5~2分鐘左右（然后顯微鏡觀察細胞的消化情況，據(jù)情況調(diào)整時間）。然后吹打細胞（培養(yǎng)瓶的每個角落都要吹打，盡量避免氣泡），讓他們徹底成為一盤散沙。

5.終止分裂：盡快加入培養(yǎng)基，終止trypsin的七傷拳。培養(yǎng)基的量：trypsin的2倍左右。

6.離心機（可選）：必要時，或者閑著沒事干，800轉(zhuǎn)左右，離心3~5分鐘，吸走上清液，徹底清除胰酶的七傷拳。

7.三國演義：把細胞平均分成3份左右，分裝在新的培養(yǎng)瓶。按照瓶子大?。?/span>T25號4~5ml），加入培養(yǎng)基（10~20%FBS+雙抗）。

8.培養(yǎng)：搖勻（然后顯微鏡偷窺）。放入溫箱（37度，5%CO2），讓他們自生自滅。

細胞凍存

先把凍存液配好！細胞計數(shù)器消毒（也可以不消毒）！凍存管！

細胞凍存液:70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS + 10% DMSO（二甲基亞砜，DiMethyl SulfOxide）

1.消化細胞：去除培養(yǎng)基，PBS洗3~5次，0.05%胰蛋白酶消化細胞，37度培養(yǎng)箱1.5~3分鐘，然后加入2倍體積培養(yǎng)基終止消化。

2.離心：800~1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3~5分鐘，去除上清液。

3.重懸：細胞凍存液（70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS + 10% DMSO）重懸細胞，吹打均勻，密度為5~10×10⁶個/ml，每管1毫升（25號培養(yǎng)瓶搞2管左右），標記。

4.凍存：細胞凍存盒+異丙醇，先放-80度過夜，然后放入液氮罐。

備注：先把程序降溫盒放常溫，看看里面的異丙醇到不到刻度，不到要補夠（總量250ml）。凍存液不用加抗生素。

細胞鋪板

原因：把細胞分成多份，為后續(xù)研究做準備，過程和細胞傳代一樣。具體鋪多少，根據(jù)研究目標決定。細胞鋪板以后，只能使用，不能傳代了。

1.清洗+裂開細胞：PBS清洗兩三次，加入胰酶1mL裂開細胞大約2分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰酶的七傷拳，離心細胞，丟棄上清液。

2.測細胞濃度：再次加入培養(yǎng)基1毫升吹打細胞（加多了反而不好把細胞吹打均勻），然后加入2毫升，輕輕地，吹打液體，讓細胞均勻的分布在溶液中，在玻片上滴入10~20ul細胞液測細胞濃度！

3.鋪板濃度：每個培養(yǎng)孔的細胞濃度都要相同，鋪板濃度為2～8×10e4/ml。

比如，測量下來，細胞濃度為1×10e6 = 100×10e4/ml。設(shè)定所有孔的濃度為5×10的4次方／mL，那么稀釋20倍就可以啦。

假如每個孔放1毫升營養(yǎng)液，就是1000微升，那么，加入950微升營養(yǎng)液+50微升之前的細胞液體。

4.收工：按照培養(yǎng)小罐的體積加入培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基搖勻，放入37度培養(yǎng)箱。

病毒滴度測定

準備：檢測前一天，將293A細胞鋪板于48孔板中，3.0-8.0 × 10⁴/孔。

1.配制培養(yǎng)基：DMEN培養(yǎng)基+FBS（胎牛血清）+Polybrene+雙抗生素，讓FBS的濃度為10~20%，Polybrene在原來的基礎(chǔ)上稀釋2000倍，讓工作濃度為2~10ug/ml。

2.分裝培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)瓶的要求，每個孔加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。48孔板，加270μLDMEM培養(yǎng)液（含polybrene）。

3.加入病毒：慢病毒稀釋2倍。加30 μL病毒原液于第一個EP管中，充分混勻，從中再取30 μL加入下一管EP。依次進行梯度稀釋至10萬倍。

4.門診隨訪：24小時后，PBS洗出含病毒的培養(yǎng)基（用吸管吸入離心管，放入專門的黃色垃圾袋處理），換入新的培養(yǎng)基。

48小時后，拍照，看看免疫熒光情況。

72小時后，拍照，看看免疫熒光情況。換入新的培養(yǎng)基。

5.滴度計算方法：

Virus Titer = cell numbers (of EGFP)× dilution factor/volume (ml) = Titer/ml

例如：10^-6孔有六個熒光，即Virus Titer=6 × 10⁶ /0.25 (ml) = 2.4 × 10⁷ /ml

慢病毒感染靶細胞

1.鋪板：感染前12-18h，將靶細胞鋪板于6-孔板上（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)），第二天感染前，不超過40%-50%的細胞融合。

2.凍融病毒：輕輕混合凍融的病毒液，不要渦旋。雖然濃縮試劑可保持凍融后的病毒活性，亦應(yīng)注意避免使用反復凍融的病毒液。

3.配置感染試劑：根據(jù)靶細胞的培養(yǎng)液的量調(diào)節(jié)病毒和聚凝胺（polybrene）的添加量。病毒感染過程中聚凝胺（polybrene）的最終濃度5-10μg/ml（根據(jù)不同細胞而不同，推薦使用5μg/ml）。

4.轉(zhuǎn)染：在靶細胞中加入病毒懸液，感染8-24h。

5.換液：感染8小時左右后，移除丟棄存留病毒的感染培養(yǎng)液，換成新鮮的生長培養(yǎng)液。注意：廢棄的培養(yǎng)液包含可感染的慢病毒。所有接觸慢病毒的物品，最后均需要滅活處理再丟棄。

6.培養(yǎng)：繼續(xù)培養(yǎng)細胞24-48h，在靶細胞中積累基因產(chǎn)物。

7.收集細胞：收集細胞進行分析，或者puromycine抗生素再進行篩選。

收集細胞：核酸篇

培養(yǎng)平板最好放置冰上，加入裂解液（6孔板加1毫升），吹打培養(yǎng)皿的底部，把細胞吹起來，然后吸入EP管，放置冰上，全部操作完成后，-80度保存?zhèn)溆谩?/span>

收集細胞：蛋白質(zhì)

1.照射熒光：轉(zhuǎn)染病毒且換液后72小時后看看熒光情況，初步了解細胞有沒有轉(zhuǎn)染病毒，沒有熒光基本上可以丟了。

2.配置裂解液：蛋白質(zhì)裂解液mRIPPA+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑，旋渦震蕩5秒，然后放在冰上。六孔板每孔200~300ul，最好多配100~500ul，因為后面要稀釋蛋白質(zhì)濃度。

3.裂開：培養(yǎng)皿盡量放冰上，加入混合裂解液，冰上放置5分鐘以上，然后用干凈的細胞刮將細胞刮下（上下左右東西南北四面八方都盡量刮到），用移液槍收集細胞放入1.5ml的EP管內(nèi)，放置冰上待離心。

4.離心：提前預冷4°離心機，蛋白質(zhì)樣品旋渦震蕩5分鐘，12000rpm（或g）離心5~15min。

5.收集：將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)，做好標記，若不進行蛋白質(zhì)定量，于-80°冰箱長期保存。

6.BCA測蛋白質(zhì)濃度

6.1配液：配置工作液，A液與B液的比例為50：1，配置好后旋渦震蕩5秒以上，放冰上。

96孔板，每孔100ul。

假如10個樣品，一個副孔，就是20*100=2000ul。

標準品減半稀釋6次，濃度分別為：1倍，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，總共7個孔，加上1個副孔，總共14孔，就是：14*100=1400ul。

總共的液體就是2000+1400。

6.2加液：樣本量與工作液的比例為20：1，每個孔加95ul工作液，5ul蛋白質(zhì)。

6.3孵育：加樣完成，37度孵育30分鐘。

6.4測濃度：放入機器測濃度，先開機，再打開軟件。96孔板的A對著機器的A，蓋子不能放進去。按照機器的模式測濃度，繪制標準曲線，按照濃度最小的管子，把所有的管子的濃度稀釋成一樣的（盡量用混合裂解液稀釋，沒有么用ddH2O稀釋）。濃度最小的管子，投入的體積=體積最小的管子。剩余的樣品放-80度冰箱。

7.配置WB上樣液：加入蛋白質(zhì)loading，95度煮5~10分鐘，-20度保存。假如是5×的loading，loading的量就是蛋白質(zhì)體積的1/4，6×的就是1/5。

細胞的傳代培養(yǎng)