Focus | mRNA展示技術(shù)：新起之秀or轉(zhuǎn)瞬花火？

依薷書(shū)坊 2021-11-13

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目前，體外定向進(jìn)化已被廣泛用于篩選具有改善的結(jié)合或催化特性的核酸分子。由于蛋白質(zhì)在生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用，且已廣泛應(yīng)用于診斷、制藥和工業(yè)等領(lǐng)域，因此，學(xué)者們對(duì)蛋白質(zhì)體外篩選和定向進(jìn)化方法的開(kāi)發(fā)產(chǎn)生了極大的興趣。然而，開(kāi)發(fā)有效的蛋白質(zhì)進(jìn)化方法面臨的主要障礙是：在蛋白質(zhì)翻譯后難以恢復(fù)編碼蛋白質(zhì)序列的信息。

噬菌體展示、質(zhì)粒展示技術(shù)等可通過(guò)在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯解決上述難題，通過(guò)這些技術(shù)所得的蛋白能保持與編碼核酸的物理連接，并被回收用于擴(kuò)增和進(jìn)一步篩選。然而，此類(lèi)技術(shù)受限于生成文庫(kù)的復(fù)雜性，如在噬菌體展示技術(shù)中，構(gòu)建文庫(kù)和篩選涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染，文庫(kù)容量受轉(zhuǎn)染效率的限制(通常被限制在10⁹~10¹⁰)，降低了文庫(kù)篩選效率。

設(shè)計(jì)體外蛋白質(zhì)篩選方案的困難在于，雖然體外篩選涉及篩選和擴(kuò)增的迭代循環(huán)，但沒(méi)有簡(jiǎn)單的方法來(lái)擴(kuò)增已被篩選的功能性蛋白質(zhì)分子。1990s，研究者們開(kāi)發(fā)了核糖體展示技術(shù)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是完全在體外開(kāi)展，并能獲得更大的文庫(kù)(＞10¹²)；然而體外篩選必須在保持核糖體-mRNA-peptide三元復(fù)合物完整性的前提下進(jìn)行。可喜的是，隨著科學(xué)家們不斷的探索，一種更簡(jiǎn)單、更強(qiáng)大的體外篩選方法——mRNA展示技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。它是否會(huì)帶來(lái)驚喜呢？

中心法則

圖1.中心法則示意圖

在介紹mRNA展示技術(shù)前，我們先來(lái)回顧一個(gè)重要概念——中心法則，即DNA通過(guò)RNA將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)，從而完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄/翻譯的過(guò)程；也可指DNA間完成遺傳信息的傳遞，從而實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的過(guò)程。

DNA在進(jìn)入細(xì)胞核后將遺傳信息傳遞給信使RNA，即mRNA，完成“轉(zhuǎn)錄”；mRNA離開(kāi)細(xì)胞核并將攜帶的遺傳物質(zhì)到達(dá)制造蛋白質(zhì)的場(chǎng)所——由rRNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成的核糖體，此時(shí)，tRNA攜帶氨基酸到達(dá)核糖體中，后者按照mRNA攜帶的遺傳信息將氨基酸合成蛋白質(zhì)，這一過(guò)程稱(chēng)為“翻譯”。理論上，我們可以通過(guò)人工編輯mRNA合成幾乎任何蛋白質(zhì)。

中心法則是所有具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。只要掌握了中心法則，mRNA展示技術(shù)的基本原理也能輕而易舉地理解。

mRNA展示技術(shù)的原理

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關(guān)鍵步驟

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mRNA展示技術(shù)又稱(chēng)mRNA-蛋白質(zhì)融合體展示技術(shù)，是將基因型（mRNA）與表型（蛋白質(zhì)）融合的體外多肽/蛋白質(zhì)篩選技術(shù)，可用于生物分子配體的發(fā)現(xiàn)和相互作用分析。mRNA展示技術(shù)主要有7大步驟，包括：

(1) 構(gòu)建編碼mRNA的DNA庫(kù)。構(gòu)建大容量隨機(jī)DNA庫(kù)用于編碼mRNA，并對(duì)DNA進(jìn)行特殊加工：在5’端添加T7聚合酶啟動(dòng)子、翻譯增強(qiáng)子、翻譯起始密碼子等序列；3’端不加終止密碼子，并添加親和純化標(biāo)簽；

(2) RNA轉(zhuǎn)錄并與嘌呤霉素連接。在體外利用T7聚合酶將DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA后，通過(guò)如寡核苷酸等連接子將mRNA的3’端和嘌呤霉素結(jié)合；

(3) 體外翻譯，形成mRNA-肽復(fù)合物。核糖體以帶有嘌呤霉素的mRNA為模板進(jìn)行體外翻譯，并生成新肽鏈，嘌呤霉素進(jìn)入核糖體并中止體外翻譯，使mRNA和新生肽鏈形成mRNA-肽復(fù)合物，并從含核糖體及其他成分的反應(yīng)液中純化出來(lái)；

(4) cDNA逆轉(zhuǎn)錄，形成cDNA/mRNA-肽復(fù)合物。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng)，對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而得到與蛋白質(zhì)結(jié)合mRNA的互補(bǔ)DNA鏈，即cDNA，生成cDNA/mRNA-肽復(fù)合物，以穩(wěn)定核酸成分并加速篩選后基因信息的恢復(fù)；

(5) 篩選，分離。采用ELISA、磁珠法等，將目標(biāo)靶點(diǎn)固定化于固相載體上，篩選出可特異性結(jié)合目標(biāo)靶點(diǎn)的cDNA/mRNA-蛋白質(zhì)融合體，并將無(wú)法結(jié)合的cDNA/mRNA-蛋白質(zhì)融合體分離；

(6) 擴(kuò)增，獲得下一輪篩選的DNA模板。在高pH下將cDNA/mRNA-蛋白質(zhì)融合體中的mRNA水解，釋放cDNA鏈，并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為下一輪篩選提供DNA模板或測(cè)序，這一階段利用易錯(cuò)PCR可增加以擴(kuò)增DNA為中心的序列多樣性。

(7)富集，得到目標(biāo)蛋白和基因序列。依靠DNA庫(kù)的多樣性和靶點(diǎn)作用，在進(jìn)行4～10輪篩選后，可富集高親和力結(jié)合靶點(diǎn)的多肽序列。

圖2.mRNA展示技術(shù)體外篩選循環(huán)流程

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核心要素和步驟

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mRNA展示技術(shù)的核心要素為嘌呤霉素，核心步驟是通過(guò)嘌呤霉素形成mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。嘌呤霉素為一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，由于具有與酪氨酰-tRNA末端相似的結(jié)構(gòu)，因此能與氨基酸結(jié)合。然而，與酪氨酰-tRNA中的可裂解酯鍵相比，嘌呤霉素具有不可水解的酰胺鍵，會(huì)干擾翻譯，并導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物過(guò)早釋放。

圖3.嘌呤霉素和氨酰tRNA結(jié)構(gòu)對(duì)照

通過(guò)寡核苷酸連接子將嘌呤霉素與mRNA的3’端連接，通過(guò)核糖體的體外翻譯作用，以帶有嘌呤霉素的mRNA為模板，進(jìn)行編碼序列并翻譯成新生肽鏈。此時(shí)，嘌呤霉素會(huì)與氨酰化的tRNA發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，前者進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)，通過(guò)結(jié)構(gòu)上的O-甲基酪氨酸會(huì)與新生肽鏈的C端氨基酸形成穩(wěn)定的酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接，生成mRNA-肽復(fù)合物，并進(jìn)行親和純化，以除掉反應(yīng)液中核糖體等其他成分。

圖4.mRNA-肽復(fù)合物形成過(guò)程

然而，需要注意的是，此時(shí)純化出來(lái)的復(fù)合物還不能用于篩選。這主要是因?yàn)?，mRNA在篩選過(guò)程易出現(xiàn)降解，且RNA中的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)與靶點(diǎn)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，產(chǎn)生干擾。為此，mRNA展示技術(shù)的創(chuàng)始人Szostak于2000年提出了相應(yīng)的解決辦法：對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，形成cDNA/mRNA-肽復(fù)合物來(lái)穩(wěn)定核酸。其中，cDNA通過(guò)RT-PCR得到。使用cDNA/mRNA-肽復(fù)合物可加速篩選后基因信息的恢復(fù)，且限制較小。

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技術(shù)演變

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mRNA展示技術(shù)發(fā)明最初并不包含cDNA逆轉(zhuǎn)錄，在1997-2006年間，研究人員不斷對(duì)mRNA基礎(chǔ)方法進(jìn)行優(yōu)化，而自2006年開(kāi)始，該項(xiàng)技術(shù)開(kāi)始不斷在高通量篩選方面應(yīng)用：

1997年，Jack W.Szostak和Richard W.Roberts創(chuàng)造性地將嘌呤霉素共價(jià)連接在mRNA片段的3'端，實(shí)現(xiàn)了mRNA與多肽的連接。最初，該技術(shù)采用夾板法，通過(guò)寡核苷酸連接子實(shí)現(xiàn)嘌呤霉素與mRNA的連接，但連接效率較低，mRNA-肽復(fù)合物的形成率僅1%~10%。

2000年，Szostak在原有mRNA展示技術(shù)的基礎(chǔ)上，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，解決了RNA二、三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的干擾問(wèn)題，并將mRNA-肽復(fù)合物的形成率提高至40%。另一方面，Kurz等改用帶補(bǔ)骨脂素的DNA連接子，通過(guò)光交聯(lián)反應(yīng)與mRNA3'端雜交，將mRNA-肽融合體的形成率提高至40%。但該方法和夾板法都含有雜交的DNA 雙鏈序列，會(huì)影響mRNA 3'端的穩(wěn)定性。

2003年，Miyamoto-Sato等使用Fluor-PEG Puro(p(dCp)2-T(Fluor)p-PEGp-(dCp)2-puromycin)連接子通過(guò)單鏈酶連接法得到了更加穩(wěn)定高效的嘌呤霉素-mRNA模板，mRNA-肽復(fù)合物形成率可高達(dá)70%，并引入熒光素替代放射性標(biāo)記。

2006年，Hiroaki Suga在Microtechnologies in Medicine and Biology國(guó)際會(huì)議上發(fā)表關(guān)于Flexizyme的研究成果，使mRNA展示技術(shù)在大環(huán)化合物類(lèi)藥物高通量篩選開(kāi)發(fā)中的地位受到重視。

2009年，Tabata等將mRNA展示技術(shù)與微流控系統(tǒng)結(jié)合用于單鏈抗體片段(scFv)的體外篩選和進(jìn)化，每輪體外的富集率高達(dá)10⁶~10⁸，僅經(jīng)1~2輪體外篩選就從~10¹²天然隨機(jī)scFv文庫(kù)中獲得了高親和力的特異性抗體。

2011年，Szostak等將mRNA展示技術(shù)應(yīng)用于從體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫(kù)中酶的篩選和進(jìn)化。

2012年，Szostak等將mRNA展示技術(shù)應(yīng)用于大部分為非天然氨基酸的大環(huán)肽的進(jìn)化，體外篩選出用作凝血酶緊密結(jié)合抑制劑的大環(huán)肽。

2018年，Emil等人開(kāi)發(fā)了一種可實(shí)現(xiàn)高通量篩選碳?xì)浠嫌啎?shū)肽的mRNA展示技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)獲得的肽均含有α-甲基半胱氨酸，并通過(guò)二溴二甲苯環(huán)化。

圖5.mRNA展示技術(shù)的發(fā)展里程碑

mRNA展示技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及其應(yīng)用

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優(yōu)勢(shì)

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mRNA展示技術(shù)屬于體外展示技術(shù)，與包括噬菌體展示技術(shù)在內(nèi)的體內(nèi)展示技術(shù)相比，具有多種優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在文庫(kù)多樣性和性質(zhì)、篩選過(guò)程和實(shí)驗(yàn)周期方面。

文庫(kù)多樣性

噬菌體展示技術(shù)等體內(nèi)展示技術(shù)在構(gòu)建庫(kù)和篩選的過(guò)程中，需要依靠活細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增，因此，文庫(kù)容量會(huì)受到細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，如噬菌體展示技術(shù)受限于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率，其構(gòu)建的肽庫(kù)容量通常小于10¹⁰。而mRNA展示技術(shù)的表達(dá)和篩選均在體外進(jìn)行，無(wú)需依靠細(xì)胞，因此，去除了轉(zhuǎn)化和克隆步驟，因此其文庫(kù)多樣性更高，庫(kù)容高達(dá)10¹²-10¹⁴。

表1.各類(lèi)展示技術(shù)創(chuàng)建的文庫(kù)容量對(duì)比

不僅如此，體內(nèi)展示技術(shù)還面臨其它限制，包括：篩選環(huán)境必須與細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境相似、需考慮表達(dá)的毒蛋白對(duì)宿主的影響、融合蛋白活性的下降及動(dòng)力學(xué)范圍的縮小等。而各種體外展示技術(shù)不會(huì)受展示系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的影響，且可通過(guò)與體外翻譯體系(如PURE系統(tǒng))結(jié)合，解決了體內(nèi)展示系統(tǒng)存在的這些問(wèn)題。篩選過(guò)程較為簡(jiǎn)單。

而相較于體內(nèi)篩選，體外篩選更容易引入隨機(jī)突變。mRNA展示技術(shù)可通過(guò)反復(fù)的隨機(jī)突變和篩選, 使蛋白質(zhì)進(jìn)化，提高文庫(kù)多樣性。目前，隨機(jī)誘變廣泛用于定向進(jìn)化中的突變，以分離具有所需功能的序列。mRNA展示技術(shù)在每一輪篩選中都使用PCR來(lái)擴(kuò)增cDNA，由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物可直接用于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，與基于PCR的誘變和重組技術(shù)高度兼容。

文庫(kù)性質(zhì)

在許多方法中，表達(dá)蛋白質(zhì)所在的密碼子序列上下文可深刻影響生成文庫(kù)的性質(zhì)，如噬菌體展示依賴(lài)于細(xì)菌中的翻譯機(jī)制進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，酵母雙雜交僅限于酵母細(xì)胞，也可以使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但效率較低。很多時(shí)候，由于折疊、運(yùn)輸、膜插入和復(fù)合問(wèn)題，對(duì)某些蛋白質(zhì)和支架的體內(nèi)篩選偏差會(huì)增加。同時(shí)，部分未折疊的蛋白質(zhì)通常會(huì)在細(xì)胞內(nèi)迅速降解。這些問(wèn)題可能導(dǎo)致功能分子的丟失或限制篩選文庫(kù)的性質(zhì)，而mRNA 展示技術(shù)則不受這些因素的限制。

篩選過(guò)程中的反應(yīng)條件

在篩選過(guò)程中，mRNA展示技術(shù)面臨的條件限制較少。如酵母雙雜交展示技術(shù)，由于相互作用發(fā)生在細(xì)胞核中，其反應(yīng)條件不容易控制；核糖體展示技術(shù)需要在極溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行。相比之下，mRNA展示技術(shù)的篩選過(guò)程可在更嚴(yán)苛的條件下進(jìn)行，包括無(wú)天然氨基酸、非尋常的pH值和溫度條件、非生理環(huán)境等, 只要表型和基因型間的連接足夠牢固，就不易受到其它條件的干擾。

試驗(yàn)周期

親和力篩選結(jié)束后，篩選產(chǎn)生的DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后即可進(jìn)入下一個(gè)展示循環(huán)，從而極大地縮短實(shí)驗(yàn)周期。

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應(yīng)用

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目前，研究人員通過(guò)體外展示方法篩選的高親和力、特異性靶結(jié)合分子的成功例子包括肽、抗體、酶和工程支架，如纖連蛋白 III 型結(jié)構(gòu)域和合成錨蛋白，這兩者均可以模擬抗體功能。

作為體外展示方法的一種，mRNA展示技術(shù)主要應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)RNA、小分子、蛋白質(zhì)等新的蛋白質(zhì)配體，闡明蛋白質(zhì)與藥物在細(xì)胞中的相互作用機(jī)制等。具體而言，可用于篩選高親和力的反應(yīng)物、抗體單鏈結(jié)構(gòu)域的模擬肽、各種抗體重鏈結(jié)構(gòu)域及與ATP、RNA、鏈親和素及蛋白質(zhì)等特異結(jié)合的多肽。此外, mRNA展示技術(shù)的其它特殊應(yīng)用還包括: 自我組裝蛋白質(zhì)芯片和用非天然氨基酸和化學(xué)修飾多肽構(gòu)建文庫(kù)。

mRNA展示技術(shù)的技術(shù)難點(diǎn)

技術(shù)難點(diǎn)

然而，盡管mRNA展示技術(shù)由于其突出的優(yōu)勢(shì)擁有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景，該技術(shù)仍存在一些難點(diǎn)/劣勢(shì)。

首先，由于mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成率和穩(wěn)定性是影響mRNA展示效率的關(guān)鍵因素，因此，對(duì)mRNA展示技術(shù)的改進(jìn)主要圍繞連接子的改造展開(kāi)，而作為技術(shù)關(guān)鍵的連接子需進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)合成。

其次，mRNA展示技術(shù)是不依賴(lài)于細(xì)胞的體外技術(shù)，而在無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系制備過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)會(huì)遭到嚴(yán)重破壞，蛋白質(zhì)在翻譯之后一般難以正常加工修飾，而蛋白分子能否正確折疊對(duì)無(wú)細(xì)胞展示效果具有決定性的影響。比如：二硫鍵的形成需要一個(gè)氧化性環(huán)境，而轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要加入一定濃度的還原劑，從而抑制了翻譯后二硫鍵橋的形成，但是二硫鍵橋卻在維持大部分蛋白分子空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著重要的作用。

另外，mRNA展示技術(shù)的難點(diǎn)還包括：mRNA及mRNA-嘌呤霉素連接產(chǎn)物也需要進(jìn)行純化才能使用；從核糖體純化mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物；DNA-mRNA在合物生成中可能出現(xiàn)拓?fù)洚悩?gòu)難題；及在翻譯過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不完整的合成產(chǎn)物等。

如開(kāi)展對(duì)上述問(wèn)題的研究，就必須在實(shí)驗(yàn)室中建立相關(guān)的技術(shù)平臺(tái)，這增加了推廣該技術(shù)的難度。

道阻且長(zhǎng)

Phylos是首家致力于開(kāi)發(fā)高通量蛋白質(zhì)芯片的蛋白質(zhì)組學(xué)公司，它通過(guò)自有的PROfusion^TM平臺(tái)創(chuàng)建了高達(dá)100萬(wàn)億個(gè)蛋白質(zhì)的文庫(kù)，用于分離合適的捕獲蛋白。憑借PROfusion^TM平臺(tái)，Phylos發(fā)現(xiàn)了含有纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(FN3)作為分子支架構(gòu)建的一類(lèi)結(jié)合蛋白家族——Trinectins，其可作為簡(jiǎn)單/可靠的抗體替代品，用于創(chuàng)建目標(biāo)結(jié)合蛋白。

2003年，一家經(jīng)歷破產(chǎn)重組后的生物制藥公司——Adnexus通過(guò)收購(gòu)Phylos并獲得了PROfusion^TM技術(shù)，并將Trinectins更名為Adnectins。在對(duì)該技術(shù)平臺(tái)的不斷推進(jìn)和發(fā)展過(guò)程中，Adnexus開(kāi)發(fā)了第一款A(yù)dnectin類(lèi)候選藥物——Pegdinetanib(計(jì)劃商品名為Angiocept?)，這是一款血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)拮抗劑，含94個(gè)氨基酸，可用作抗血管生成藥物以治療腫瘤。

PROfusion?技術(shù)平臺(tái)和Adnectins蛋白家族的可觀潛力引來(lái)了醫(yī)藥巨頭BMS的青睞。BMS于2007年初拋出了橄欖枝，與Adnexus合作開(kāi)發(fā)和商業(yè)化創(chuàng)新腫瘤藥物，在此次合作中，Adnexus 在多達(dá)6個(gè)研究項(xiàng)目中應(yīng)用了PROfusion?技術(shù)，以篩選出Adnectins先導(dǎo)化合物提供給BMS，而B(niǎo)MS負(fù)責(zé)全球的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化活動(dòng)。

隨著合作的深入，2007-09，BMS以$430Mn收購(gòu)了Adnexus，將PROfusion?和Pegdinetanib一并納入麾下，拓寬了BMS生物制劑管線和產(chǎn)品組合，也成為其向生物制藥模式戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型的重要一步。Pegdinetanib更名為BMS-844203，于2007-10進(jìn)入治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的Ⅱ期臨床，并于2009-06進(jìn)入治療非小細(xì)胞肺癌的Ⅱ期臨床。根據(jù)ClinicalTrials，其治療非小細(xì)胞肺癌的Ⅱ期臨床已終止，計(jì)劃于2013-11在日本啟動(dòng)的治療腫瘤的Ⅰ期臨床申請(qǐng)也已撤回。經(jīng)小編調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該候選藥物已無(wú)任何最新相關(guān)進(jìn)展，關(guān)于BMS和PROfusion?的相關(guān)報(bào)道也近乎于無(wú)。

Pegdinetanib和PROfusion?的相關(guān)研究為何突然“銷(xiāo)聲匿跡”，原因尚不可知。就目前已掌握的少量信息，并基于前述中提到的各種技術(shù)難點(diǎn)，小編大膽猜測(cè)，或許在mRNA展示技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中，研究人員們遇到了尚無(wú)法解決的技術(shù)性難題，從而導(dǎo)致研究中斷。

圖6.Pegdinetanib的分子結(jié)構(gòu)

相關(guān)技術(shù)和企業(yè)

Ra Pharmaceuticals

Ra Pharma成立于2008年，總部位于美國(guó)，聚焦于補(bǔ)體生物學(xué)領(lǐng)域，專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)靶向補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵組分的多肽和小分子療法，旨在為罕見(jiàn)病患者提供創(chuàng)新療法。Ra Pharma的聯(lián)合創(chuàng)始人是mRNA展示技術(shù)的發(fā)明人Szostak教授，其核心技術(shù)是基于Szostak教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的大環(huán)多肽mRNA展示技術(shù)Extreme Diversity?平臺(tái)。通過(guò)該平臺(tái)可獲得高度特異性和穩(wěn)定的肽分子、極大提高了生物利用度、改善了細(xì)胞滲透性，解決了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及其他阻礙成藥的問(wèn)題。

圖7.ExtremeDiversity?肽庫(kù)篩選平臺(tái)

基于Extreme Diversity?，Ra Pharma開(kāi)發(fā)了新型大環(huán)肽類(lèi)C5補(bǔ)體抑制劑Zilucoplan，它是一個(gè)含有十五個(gè)氨基酸的環(huán)狀多肽，能以亞納摩爾親和力結(jié)合補(bǔ)體C5，通過(guò)共價(jià)抑制C5蛋白分裂成C5a蛋白和 C5b蛋白而發(fā)揮作用。此前，Zilucoplan已獲得FDA授予的孤兒藥資格，用于治療全身性重癥肌無(wú)力(gMG)。

圖8.Zilucoplan作用機(jī)制

正是由于Ra Pharma在補(bǔ)體抑制劑領(lǐng)域的新型技術(shù)和潛在優(yōu)勢(shì)，2019-10，公司以$2.1Bn被UCB收購(gòu)，后者由此進(jìn)入補(bǔ)體藥物領(lǐng)域。根據(jù)協(xié)議，雙方將繼續(xù)推進(jìn)Zilucoplan在治療gMG等罕見(jiàn)疾病的開(kāi)發(fā)。

PeptiDream

PeptiDream成立于2006年，是一家源自東京大學(xué)的生物創(chuàng)新藥公司，致力于約束肽/活性大環(huán)分子的快速篩選發(fā)現(xiàn)。公司的核心技術(shù)為PDPS技術(shù)平臺(tái)，后者能高效率生產(chǎn)高度多樣化(萬(wàn)億級(jí))的非標(biāo)準(zhǔn)多肽庫(kù)，以鑒定高效和選擇性強(qiáng)的靶向肽分子，從而開(kāi)發(fā)基于多肽、小分子或PDC的療法。

圖9. PeptiDream主要的藥物開(kāi)發(fā)方向

PDPS技術(shù)平臺(tái)主要由3項(xiàng)主要技術(shù)組合而成：

Flexizyme及PDTS：Flexizyme是一種體外進(jìn)化的核酶，由共同創(chuàng)始人Suga發(fā)現(xiàn)。Flexizyme能高效地使幾乎任何天然/非天然氨基酸的所有tRNA帶電，正是這創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)使mRNA展示技術(shù)在大環(huán)化合物類(lèi)藥物高通量篩選開(kāi)發(fā)中的地位更顯舉足輕重。Suga實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用flexizyme來(lái)生成氨基酸活化的tRNA，并應(yīng)用于體外翻譯系統(tǒng)——FIT系統(tǒng)。在FIT系統(tǒng)中，研究人員先使用flexizyme對(duì)要引入的衍生型非天然氨基酸與相應(yīng)tRNA進(jìn)行連接，并將其作為氨基酸元件加入到PURE系統(tǒng)中，經(jīng)翻譯后引入生成的多肽鏈，從而獲得非天然多肽(如自發(fā)成環(huán)的多肽等)(圖9 a)?；诖?，Suga實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了名為RaPID的技術(shù)平臺(tái)，可快速構(gòu)建并篩選庫(kù)容量超過(guò)10¹²的非天然環(huán)肽化合物庫(kù)(圖9 b)。PDPS便是RaPID改進(jìn)后的技術(shù)平臺(tái)。

PDTS(肽發(fā)現(xiàn)翻譯系統(tǒng))是一種無(wú)細(xì)胞的完全重組的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，它本身只能制備由20種天然氨基酸組成的肽庫(kù)，但與Flexizyme技術(shù)結(jié)合使用時(shí)，可以構(gòu)建由400多種不同氨基酸組成的肽庫(kù)。

圖10.FIT系統(tǒng)引入非天然氨基酸流程(a)及RaPID平臺(tái)的篩選流程(b)

肽的環(huán)化技術(shù)：PDPS能構(gòu)建各種約束/或環(huán)化肽庫(kù)。與線性肽相比，約束肽具有許多顯著優(yōu)勢(shì)，包括更高的親和力、更強(qiáng)的選擇性和卓越的體內(nèi)穩(wěn)定性。除環(huán)化技術(shù)外，PDPS 還結(jié)合了多種修飾技術(shù)，有助于快速篩選候選肽，顯著加快了藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程。

PD技術(shù)：利用該技術(shù)可快速生成高度多樣化的肽文庫(kù)，這些肽文庫(kù)可針對(duì)任何生物目標(biāo)(包括特定蛋白、抗體等)進(jìn)行篩選并識(shí)別候選肽分子。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)十分簡(jiǎn)化且效率非常高。

公司的業(yè)務(wù)主要由合作開(kāi)發(fā)、許可授權(quán)、戰(zhàn)略合作/自主開(kāi)發(fā)共3大板塊構(gòu)成。公司在專(zhuān)注于核心技術(shù)的創(chuàng)新與改進(jìn)的同時(shí)，還在廣泛合作中擴(kuò)大自己的影響力并獲取收益。目前，公司已與多家大型制藥企業(yè)建立研發(fā)合作關(guān)系，其中Novartis、Lilly、Genentech、Merck等公司不僅與其簽訂了合作開(kāi)發(fā)協(xié)議，還直接引進(jìn)了核心的PDPS篩選技術(shù)。

截至2021-06-30，公司共有120個(gè)在研項(xiàng)目：82個(gè)肽/小分子候選藥物和40個(gè)PDC候選藥物。在研項(xiàng)目多數(shù)處于靶點(diǎn)驗(yàn)證→苗頭化合物和苗頭化合物→先導(dǎo)化合物階段。其中，有40項(xiàng)處于靶點(diǎn)驗(yàn)證→苗頭化合物階段；55項(xiàng)處于苗頭化合物→先導(dǎo)化合物階段；16項(xiàng)先導(dǎo)化合物→GLP毒理試驗(yàn)階段；9項(xiàng)GLP毒理試驗(yàn)→臨床申請(qǐng)階段。目前進(jìn)入Ⅰ期臨床的有2項(xiàng)，暫無(wú)進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床的候選藥物。

圖11.PeptiDream Pipeline

Elpis Biopharmaceuticals

2017年夏天，曾在Phylos任職6年的Dr. 陳彥在美國(guó)創(chuàng)辦了Elpis Biopharmaceuticals，這是一家致力于開(kāi)發(fā)多功能免疫療法的生物制藥公司，旨在通過(guò)激活免疫系統(tǒng)來(lái)克服腫瘤耐藥性。Elpis建立了自有的mRNA展示技術(shù)平臺(tái)：mRNADis^TM和mSCAFold^TM。2020-10-29，Elpis完成$30Mn的A輪融資，與種子輪融資合計(jì)共籌得資金$40Mn。

mRNADis^TM是容量為10¹³的全人類(lèi)抗體文庫(kù)，利用可溶性蛋白/活細(xì)胞進(jìn)行篩選，這有利于生成與疾病相關(guān)表位和與具有挑戰(zhàn)性的靶點(diǎn)(如多跨膜蛋白)特異性結(jié)合的抗體，因而能快速發(fā)現(xiàn)針對(duì)治療靶點(diǎn)的高特異性、強(qiáng)效的ScFv和VH域抗體模塊。同時(shí)，由于該文庫(kù)的抗體為全人源，有助于開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性高、免疫原性較低的可溶性抗體。

mSCAFold^TM是Elpis基于對(duì)感興趣的靶點(diǎn)及其相互作用要素間結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解定制的庫(kù)，可進(jìn)行表位定向篩選。研究人員利用該平臺(tái)篩選和鑒定具有重定向藥理學(xué)特性(如激動(dòng)劑、拮抗劑)的工程突變體，用于藥品開(kāi)發(fā)。

圖12.Elpis技術(shù)平臺(tái)

目前，公司的在研藥物主要分為兩類(lèi)：實(shí)體瘤靶向免疫調(diào)節(jié)劑和用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的細(xì)胞療法，分別有4款候選藥物。腫瘤靶向免疫調(diào)節(jié)劑方面，EPIM-001為進(jìn)展最快的候選藥物，處于臨床前階段，計(jì)劃于2022Q1提交IND申請(qǐng)；EPB-002為雙特異性調(diào)節(jié)劑，主要靶向胰腺和膀胱的實(shí)體瘤。細(xì)胞療法方面，EPC-001是進(jìn)展最快的候選藥物，為靶向CD22/CD19的調(diào)節(jié)劑，用于治療R/R性B細(xì)胞惡性腫瘤，計(jì)劃于今年啟動(dòng)由研究者發(fā)起的臨床研究。

圖13.Elpis Pipeline

結(jié)語(yǔ)

mRNA展示技術(shù)解決了噬菌體展示、酵母表面展示等體內(nèi)展示技術(shù)面臨的多數(shù)困難，為構(gòu)建更多樣化的文庫(kù)提供了可能，有助于蛋白質(zhì)體外篩選技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。然而，mRNA展示技術(shù)也有其自身的局限性，目前仍主要停留在實(shí)驗(yàn)階段。未來(lái)該技術(shù)又將何去何從？是驚艷四方還是黯然退場(chǎng)？結(jié)局仍未可知……

| 引用資料

[1] 生物制藥小編. mRNA展示技術(shù).

[2] 抗體密碼. 無(wú)細(xì)胞展示技術(shù)——核糖體/mRNA/cDNA.

[3] 張萬(wàn)巧等. mRNA展示技術(shù).

[4] 鄒媛等. 分子文庫(kù)展示技術(shù).

[5] 閻松等. 體外展示技術(shù).

[6] 盧明鋒. 體外展示技術(shù)研究進(jìn)展.

[7] mRNA display: from basic principles to macrocycledrug discovery

[8] In-vitro protein evolution by ribosomedisplay and mRNA display.

[9] RNA-peptide fusions for the in vitroselection of peptides and proteins.

[10] In Vitro Selection of Highly ModifiedCyclic Peptides That Act as Tight Binding Inhibitors.

[11] Advantages of mRNA display selectionsover other selection techniques for investigation of protein–proteininteractions.

[12] PeptiDream Website.

[13] Ra Pharmaceuticals Website.

[14] Elpis Biopharmaceuticals Website.

[15] ClinicalTrial Website.

[16] Wikipedia.

[17] genomeweb. Phylos Raises $25.1 Millionfor Protein Chip Effort.

[18] Clinical Leader Website. From MedicalResearcher To CEO.

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