1. 樣品處理及預(yù)增菌

無菌操作稱取25g（mL）樣品，置于盛有225mL緩沖蛋白胨水（BPW）的無菌均質(zhì)杯、均質(zhì)袋或合適容器內(nèi)，根據(jù)標準要求進行均質(zhì)。若樣品為液體，即可以均質(zhì)，也可以震蕩混勻。于36℃±1℃培養(yǎng)8h-18h。

前增菌的緩沖蛋白胨水（BPW），為非選擇性的增菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中緩沖體系能將培養(yǎng)基維持在較高pH，有利于受損細胞的恢復(fù)。

蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉是緩沖劑。

2. 選擇性增菌

將培養(yǎng)后BPW搖勻，取1mL轉(zhuǎn)種于10mL 四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB），于42℃±1℃培養(yǎng)18h-24h，同時再取1mL轉(zhuǎn)種于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC），于36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。

TTB增菌液的配制有兩個注意事項，一是碳酸鈣是TTB的正常成分，作用是中和吸收有毒性的代謝物質(zhì)（主要是培養(yǎng)基酸堿度的變化對菌生長的影響）。但是碳酸鈣不溶于水，所以TTB有沉淀是正常的，分裝時一定搖勻分裝。二是四硫磺酸鈉是TTB抑制性的核心成分，培養(yǎng)基也以此命名，但成分表中并沒有四硫磺酸鈉，它是在碘液煌綠加入后，硫代硫酸鈉經(jīng)碘氧化生成的。四硫磺酸鈉對大腸菌群有抑制作用，但不穩(wěn)定，所以碘液和煌綠必須在臨用前加入。

SC培養(yǎng)后，若菌生長，培養(yǎng)液會變紅，但是變紅不意味著沙門氏菌的存在，還需要往下進行。

3. 選擇性分離

將培養(yǎng)后的TTB和SC搖勻，用接種環(huán)分別劃線接種于BS瓊脂平板和XLD瓊脂平板，或HE瓊脂平板，或沙門顯色平板，于36℃±1℃分別培養(yǎng)40h-48h或18h-24h，之后觀察各個平板上菌落特征。

單菌落的菌落特征最為典型，利于觀察，為獲得大量單菌落，一般建議采用三區(qū)或四區(qū)劃線，這樣分離效果好，更容易出現(xiàn)單菌落。

BS瓊脂是沙門氏菌檢驗中的必用平板，它的優(yōu)勢在于對傷寒沙門氏菌的檢出率比傳統(tǒng)平板高30-80%不等。同時在沙門顯色培養(yǎng)基出現(xiàn)之前，對變形菌的抑制性和特異性均好于同類培養(yǎng)基。所以BS瓊脂一直是沙門氏菌選擇分離的首選培養(yǎng)基。

BS瓊脂上沙門氏菌菌落特征：菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。

XLD瓊脂上沙門氏菌菌落特征：菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。

XLD瓊脂里添加了木糖，腸道細菌幾乎都可以利用木糖，只有志賀不利用。所以志賀是無色的菌落。其中還添加了賴氨酸，沙門氏菌也能利用木糖產(chǎn)酸，這樣就不能與其他腸道菌區(qū)分開，但是大部分沙門會產(chǎn)賴氨酸脫羧酶，在酸性條件下把賴氨酸脫羧后形成的尸胺是堿性，會中和木糖產(chǎn)的酸，從而使菌落保持無色。再配合硫化氫指示系統(tǒng)，沙門就變成了我們看到的形態(tài)。乳糖和蔗糖的存在可以讓產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的大腸菌群大量產(chǎn)酸，從而與沙門氏菌區(qū)分。

四種常用培養(yǎng)基菌落形態(tài)分類如下

  不同的廠家的沙門氏顯色培養(yǎng)基，由于其培養(yǎng)基上的酶底物和顯色基團不同，所以形成的菌落特征就不同，按照廠家的說明書判斷。

4. 初步生化

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂,先在斜面劃線,再于底層穿刺;接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板,于36℃士1 C培養(yǎng)18h~24h,必要時可延長至48h。

注意：三糖鐵瓊脂要配制為高層斜面，接種針挑取菌落，于高層斜面上劃線，再穿刺（穿刺針不要破壁，不要穿透，距底部5mm左右即可）；同時用穿刺過的接種針接種賴氨酸脫羧酶反應(yīng)管（分為賴氨酸脫羧酶反應(yīng)管和對照管，兩者都有要接種，表面覆蓋2-3滴液體石蠟，防止氧化）。

需要根據(jù)下表判定菌落的可疑性，來確定是否再進行下一步的生化鑒定。

5. 生化鑒定

確定可疑菌后，需要進行生化鑒定，若一個一個生化管去做，過程十分的繁瑣。根據(jù)國標“5.4.3”規(guī)定，可疑采用生化鑒定試劑盒或全自動生化鑒定系統(tǒng)進行檢測。

6. 血清學鑒定

血清學鑒定是十分必須的步驟，可判定沙門氏菌是否被O多價抗原和H多價抗原血清凝集。

采用的血清可以是進口的或者國內(nèi)生產(chǎn)的，但是國內(nèi)血清的凝集性能有時不太好，而進口血清又太貴。所以僅是判定O多價和H多價凝集的，用國產(chǎn)的就可以。

（1）以無菌干凈的玻片為載體，滴一滴生理鹽水，接種管從營養(yǎng)瓊脂平面挑取少量菌體，在生理鹽水中涂開，緩緩?fù)?，觀察凝集情況，排除自凝。

（2）滴一滴O多價血清于玻片上，重復(fù)上述步驟，判斷凝集情況，一般情況都會凝集的。除非是有Vi抗原存在時（如鼠傷寒沙門氏菌），會阻止O血清凝集，可挑取菌體至1 mL生理鹽水中制成菌懸液，于酒精燈煮沸在檢查。

（3）滴一滴H多價血清于玻片上，重復(fù)上述（1）中步驟，判斷凝集情況。若凝集效果不明顯，需要用0.6%半固體瓊脂平板誘導(dǎo)，帶菌落蔓延生長是，挑取邊緣部分進行檢查。

典型凝集效果見下圖：

7. 關(guān)鍵控制點

a、樣品處理

盡可能縮短解凍時間，使竟爭菌群生長最少，并減小對沙門氏菌的損傷致病菌取樣一定要均勻并具有代表性（蛋黃蛋清混勻取樣）。

b、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方面

（1）沒有一種培養(yǎng)基可疑準確無誤的篩選出沙門氏菌，必須選擇多種選擇性培養(yǎng)基同時篩選，只能說顯色培養(yǎng)基綜合選擇性更強。

（2）試劑和培養(yǎng)基的配置一定要嚴格按照說明書配置，是否需要高壓滅菌，添加劑用量及培養(yǎng)基保存條件。

（3）BS培養(yǎng)基是分離沙門氏菌的高效培養(yǎng)基，特別適用于傷寒類的沙門氏菌，不是所有的選擇性培養(yǎng)基都能有效分離出傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌，BS是分離傷寒類沙門氏菌的首選培養(yǎng)基。

（4）BS不能高壓，不能過熱溶解，只能在使用前一天配置，保存在陰暗處，48h后失去選擇性，保存不當，顏色變淺標明已經(jīng)開始減效。

（5）TTB的添加劑必須在棕色瓶儲存，不能見光，否則選擇性減弱。TTB有碳酸鈣沉淀，分裝時一定要搖勻，碳酸鈣作用是消除和吸收有毒代謝產(chǎn)物。TTB加入添加劑后就不能再加熱。

（6)SC種含有亞硒酸氫鈉，劇毒物質(zhì)，使用時候要注意安全，當天使用當天配置。

（7）TSI最好自己配置，制備成高柱斜面，有助于結(jié)果判讀

（8）從挑選可疑菌落開始，建議每步都同時劃線營養(yǎng)瓊脂瓊脂，確保每個菌落均為純菌。

c、生化反應(yīng)

（1）生化反應(yīng)要用純菌落進行（從營養(yǎng)瓊脂中挑取單個菌落制備成適宜濃度的菌懸液）。

（2）多種生化試驗同時測試可以提高檢測效率。