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在我們平時(shí)的微生物檢測工作中，沙門氏菌是非常常見的檢測項(xiàng)目之一，沙門氏菌屬于致病性細(xì)菌，要求在食品中每25g樣品中不得檢出沙門氏菌，因此對于沙門氏菌檢測過程中的培養(yǎng)基和試劑的要求比較高，在這里跟大家討論一下沙門氏菌的檢驗(yàn)過程及操作時(shí)的注意事項(xiàng)。 樣品加入緩沖蛋白胨水（BPW）中進(jìn)行預(yù)增菌，任何樣品均需進(jìn)行預(yù)增菌。有盆友問啦，為什么要用BPW呢？那是因?yàn)榘?，食品在加工過程中采用加熱、干燥等加工工藝使得細(xì)胞存在不同程度的受損，而緩沖蛋白胨水（BPW）呢，作為非選擇性的增菌培養(yǎng)基，較高pH的緩沖體系可以幫助受損的細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定、活力滿滿的生理狀態(tài)，此處也可使用即用型的BPW，因?yàn)樗僮鞣奖?，?jié)省時(shí)間。這里要注意啦，增菌接種前一定要把預(yù)增菌后的BPW樣品溶液輕輕搖動混勻，這樣做的原因是有些沙門君是懶得動的（因?yàn)橛行┥抽T氏菌沒鞭毛），它們會潛伏在溶液底層，所以我們要把增菌液“搖擺、搖擺”，讓不動的沙門君們在增菌液中都漂浮起來，吸出，分別接入TTB和SC培養(yǎng)基中。 此步驟防止漏檢的方式是采用兩種不同的選擇性增菌液（TTB和SC）進(jìn)行增菌，是因?yàn)樯抽T君的家族太龐大了，血清型都有2000多種，所以得加強(qiáng)引誘措施，采用不同的培養(yǎng)溫度和不同抑制性的培養(yǎng)基來給不同的沙門君提供安逸的環(huán)境來繁衍后代，同時(shí)盡量阻攔革蘭氏陽性菌和其他大多數(shù)的腸道菌來搗亂，有些細(xì)菌還是會趁虛而入的。咱們來說一下TTB和SC使用過程中的注意事項(xiàng)：TTB培養(yǎng)基：待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃以下時(shí)，加入煌綠和碘液，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有不溶解的CaCO3（用來中和吸收有毒性的代謝物質(zhì)），會有大量的白色沉淀，在分裝時(shí)應(yīng)邊搖勻邊分裝，接種后培養(yǎng)條件為：42℃±1℃培養(yǎng)18h-24h；SC培養(yǎng)基：千萬不可高壓滅菌，不可過度加熱，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。發(fā)現(xiàn)干粉或溶液變紅就不要使用了。培養(yǎng)基開封后建議用封口膜密封后冷藏保存，可延緩培養(yǎng)基變質(zhì)，接種后培養(yǎng)條件為：36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h；TTB與SC增菌液在接種選擇性分離培養(yǎng)基前，均應(yīng)輕輕搖動混勻，原因同選擇性增菌一樣，也是為了防止不運(yùn)動的沙門氏菌漏檢；混勻后，用直徑為3mm的接種環(huán)（也就是實(shí)驗(yàn)室用的10μL接種環(huán)）將TTB與SC增菌液“分別”劃線接種于兩種選擇性平板，一種是BS瓊脂，為必選的選擇性分離培養(yǎng)基，另外一種選擇性分離培養(yǎng)基是從XLD瓊脂、HE瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基中選擇一個(gè)即可；沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征參考下圖：注意：在一種選擇性瓊脂培養(yǎng)基上不同沙門氏菌會長出不同的菌落形態(tài)，在做樣品檢驗(yàn)時(shí)要參考上圖中沙門氏菌的菌落特征，將典型菌落及可疑菌落純化后做生化和血清鑒定，避免漏檢，例如：在XLD瓊脂接菌培養(yǎng)18h-24h時(shí)，鼠傷寒沙門氏菌為粉紅色菌落，呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，大腸埃希氏菌為黃色菌落，豬霍亂沙門氏菌為淡黃色菌落，比大腸埃希氏菌的顏色略淺，易混淆，為防止漏檢，XLD瓊脂平板上黃色菌落也應(yīng)做生化和血清鑒定，不可忽視。咱們來說一下選擇性瓊脂培養(yǎng)基使用過程中的注意事項(xiàng)：BS瓊脂：配制時(shí)不可高壓，煮沸滅菌即可，不可反復(fù)溶解，避免降低其選擇性；特別需要注意的一點(diǎn)是必須使用前一天配制，且在48h內(nèi)使用，超過48h也會降低其選擇性，請于室溫暗處貯存，接種后培養(yǎng)條件為：36℃±1℃培養(yǎng)40h-48h；XLD瓊脂：配制時(shí)不可高壓，煮沸滅菌即可，不可反復(fù)溶解，避免降低其選擇性，請于室溫暗處貯存；該培養(yǎng)基宜于當(dāng)天配置，第二天使用，接種后培養(yǎng)條件為：36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h； HE瓊脂：配制時(shí)不可高壓，煮沸滅菌即可，不可反復(fù)溶解，避免降低其選擇性；接種后培養(yǎng)條件為：36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h；沙門氏菌的生化和血清學(xué)鑒定試驗(yàn)的操作較繁瑣，也有較多的操作點(diǎn)需要注意，否則檢測結(jié)果容易出錯(cuò)。根據(jù)GB 4789.4-2016的表1中沙門氏菌屬的典型菌落特征描述，從選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落（用接種針自菌落中心挑?。苯咏臃N于三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，同時(shí)用接種環(huán)挑取相同菌落劃線營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化，36℃±1℃培養(yǎng)16h-24h，必要時(shí)可延長培養(yǎng)至48h。注意 三糖鐵瓊脂接種時(shí)先在斜面劃線，再于底層穿刺，但高層穿刺時(shí)接種針不能穿到底部，接種太深，否則有些菌產(chǎn)生的硫化氫會布滿試管底部，影響底層培養(yǎng)基顏色變化的觀察。建議接種后的三糖鐵瓊脂安瓿瓶用封口膜輕輕的覆蓋在瓶口，防止培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基失水干縮后氧氣進(jìn)入，底部的黃色被氧化變色，影響結(jié)果觀察；再用接種針在封口膜上扎些小孔利于培養(yǎng)過程中氧氣的供應(yīng)。原理：某些細(xì)菌在酸性厭氧環(huán)境，且有賴氨酸底物存在的情況下能誘導(dǎo)產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶，使賴氨酸脫羧產(chǎn)生堿性物質(zhì)尸胺，導(dǎo)致培養(yǎng)基變紫，但不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的細(xì)菌只能代謝葡萄糖產(chǎn)酸培養(yǎng)基變黃。注意 在進(jìn)行賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)時(shí)，注意要挑取同一個(gè)待檢菌落同時(shí)接種氨基酸脫羧酶對照管和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)管各一支，接種后在對照管和試驗(yàn)管液面上方均需加無菌液體石蠟（一定要是無菌的）覆蓋。由于氨基酸脫羧的產(chǎn)物尸胺、腐胺等遇氧不穩(wěn)定，所以需要加無菌液體石蠟覆蓋隔絕空氣，保持胺的穩(wěn)定性，確保試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。根據(jù)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果，參考GB 4789.4-2016中表2來初步判斷是否有可疑的沙門氏菌。根據(jù)表2的描述，如果遇到①三糖鐵瓊脂的試驗(yàn)管底部變紅；②整個(gè)三糖鐵瓊脂試管為黃色，并且賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)為陰性的試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，說明該菌株為非沙門氏菌，不需再做后續(xù)的生化試驗(yàn)。2.靛基質(zhì)、尿素酶和氰化鉀生長試驗(yàn)
如果初步判斷符合可疑沙門氏菌屬的生化結(jié)果時(shí)，挑取純化好的可疑菌落，再繼續(xù)做靛基質(zhì)、尿素酶和氰化鉀生長試驗(yàn)，這三步試驗(yàn)也可與三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)同時(shí)做，36℃±1℃培養(yǎng)16h-24h，必要時(shí)可延長培養(yǎng)至48h，純化后的營養(yǎng)瓊脂平板儲存于2℃-5℃或室溫至少保留24h，以便進(jìn)行后續(xù)的生化試驗(yàn)和必要時(shí)復(fù)查。將純化后的可疑菌株接種至蛋白胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h，培養(yǎng)后沿管壁緩慢的加入柯凡克試劑或歐-波試劑，若此可疑菌株可分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚與靛基質(zhì)試劑中的對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的玫瑰吲哚，為陽性；若不分解色氨酸則仍是黃色，為陰性。某些細(xì)菌產(chǎn)生的尿素酶分解尿素可產(chǎn)生大量的堿性物質(zhì)-氨，使培養(yǎng)基pH值升高，指示劑酚紅變成紅色，為陽性；在試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)待滅菌后的尿素瓊脂基礎(chǔ)冷卻至55℃時(shí)，再每95mL基礎(chǔ)中加入5mL 40%尿素水，防止基礎(chǔ)溫度過高使尿素水分解，充分混勻后分裝試管，制成斜面。該試驗(yàn)的目的是為了鑒別細(xì)菌能否被一定濃度的氰化鉀抑制而導(dǎo)致細(xì)菌不生長；若試驗(yàn)管生長渾濁為陽性，不生長且澄清的為陰性。注意 在進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)將同一株可疑菌同時(shí)接種氰化鉀對照管和試驗(yàn)管各一支；氰化鉀試驗(yàn)操作時(shí)易失敗的主要原因： 在氰化鉀對照管和試驗(yàn)管接種可疑菌株后，應(yīng)使用無菌的液體石蠟覆蓋液面，若不覆蓋，氰化鉀會逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致氰化鉀濃度降低，細(xì)菌生長，造成假陽性的結(jié)果。氰化鉀為劇毒物質(zhì)，可抑制呼吸酶，造成細(xì)胞內(nèi)窒息，吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收均可引起急性中毒，在操作該試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，避免接觸、入口或吸入。2.4生化結(jié)果鑒定廢棄處理 試驗(yàn)結(jié)果觀察結(jié)束后，在每管中加入0.5mL的40%氫氧化鉀溶液和數(shù)粒硫酸亞鐵，反應(yīng)數(shù)小時(shí)后，建議121℃高壓滅菌30min，廢棄。根據(jù)以上的試驗(yàn)結(jié)果，查詢表3對沙門氏菌屬進(jìn)行初步鑒定：當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A1時(shí)，為沙門氏菌屬的典型反應(yīng)，生化結(jié)果可初步判定為沙門氏菌；若此表格中，有1項(xiàng)不符合時(shí)，再參考表4中的“判定結(jié)果”再進(jìn)行血清或生化的驗(yàn)證試驗(yàn)；若有2項(xiàng)結(jié)果不符合時(shí)，判定為非沙門氏菌。- 若試驗(yàn)結(jié)果為第1種情況時(shí)，生化結(jié)果初步鑒定為甲型副傷寒沙門氏菌，需通過查詢WKLM抗原表，確定甲型副傷寒沙門氏菌的O抗原和H抗原的因子，再進(jìn)行血清學(xué)的驗(yàn)證試驗(yàn)。
- 若試驗(yàn)結(jié)果為第2種情況時(shí)，生化結(jié)果初步鑒定為沙門氏菌IV或V，若需分清是IV還是V，就需要按照表5做相應(yīng)的生化試驗(yàn)再進(jìn)行分群，最終的鑒定還需要參考血清學(xué)鑒定的結(jié)果共同確定。
- 若試驗(yàn)結(jié)果為第3種情況時(shí)，生化結(jié)果初步鑒定為沙門氏菌個(gè)別變體，需要再做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)。
當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A2時(shí)，需要再做甘露醇和山梨醇兩項(xiàng)試驗(yàn)，若補(bǔ)做的甘露醇和山梨醇均為陽性結(jié)果時(shí)，繼續(xù)做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)，結(jié)合血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定；當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A3時(shí)，需補(bǔ)做ONPG試驗(yàn)；若賴氨酸脫羧酶為陽性，ONPG為陰性時(shí)生化結(jié)果初步判定為沙門氏菌；若賴氨酸脫羧酶和ONPG的結(jié)果均為陰性時(shí)，生化結(jié)果初步判定為甲型副傷寒沙門氏菌。血清學(xué)鑒定試驗(yàn)是必做的項(xiàng)目，血清學(xué)分型為選做項(xiàng)目可根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室的需求選擇。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備沙門氏菌多價(jià)菌體（O）和多價(jià)鞭毛（H）診斷血清。- 1. 沙門氏菌屬的抗原結(jié)構(gòu)簡介
O抗原：也稱為菌體抗原，是細(xì)胞壁的組成成分，Ｏ抗原與抗血清的反應(yīng)呈顆粒狀；H抗原：也稱為鞭毛抗原，不同細(xì)菌的Ｈ抗原具有特異性，常作為血清學(xué)鑒定的依據(jù)之一；Ｈ抗原與抗血清的反應(yīng)呈絮狀或絨狀，大部分沙門氏菌Ｈ抗原都有兩相，第一相被稱為特異性相，第二相為非特異性相；Vi抗原：是一種特殊的菌體抗原，屬于K抗原群，如傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和都柏林沙門氏菌都含有Vi抗原。
在一塊潔凈的玻片上滴加一滴生理鹽水，挑取瓊脂量為1.2%-1.5%的培養(yǎng)基平板上純化的菌株，混合于生理鹽水滴中，混勻，成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕混動30s-60s，置于黑色背景下觀察凝集情況，若出現(xiàn)可見的菌體凝集，則認(rèn)為有自凝性，說明該菌株發(fā)生S-R變異，失去了O抗原成為粗糙型，不能進(jìn)行血清學(xué)鑒定試驗(yàn)；反之無自凝性，若無自凝性則繼續(xù)做后續(xù)的血清學(xué)試驗(yàn)。注意 在做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)中，菌株建議使用純化培養(yǎng)18-24h的新鮮菌株；菌株純化時(shí)，建議使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，盡量不用平板計(jì)數(shù)瓊脂，是因?yàn)槠桨逵?jì)數(shù)瓊脂配方中含有糖類，糖類會干擾血清學(xué)的鑒定；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂量在1.2%-1.5%之間。
在潔凈的玻片的一邊滴加一滴生理鹽水作為對照，另一邊滴加一滴O多價(jià)血清；自營養(yǎng)瓊脂平板挑取1環(huán)純化后的待測菌，在生理鹽水滴和多價(jià)菌體（O）抗血清滴上方各放1/2環(huán)待測菌，再用無菌的接種環(huán)分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌苔研磨成乳液狀，將玻片輕輕混動1min，置于黑色背景下觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。注意 研磨菌株時(shí)應(yīng)先研磨生理鹽水區(qū)域，再研磨O多價(jià)血清區(qū)域；若先研磨O多價(jià)血清區(qū)域，再研磨生理鹽水區(qū)域，有可能會把O多價(jià)血清帶入到生理鹽水區(qū)域，造成誤判。若O多價(jià)不凝集時(shí)就判定為非沙門氏菌嗎？此時(shí)需要考慮是否因?yàn)榍v膜的原因而導(dǎo)致的O多價(jià)不凝集，分為以下兩步進(jìn)行排除：- I.將菌株接種在瓊脂量較高（2%-3%）的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，再進(jìn)行O多價(jià)凝集試驗(yàn)，這里說的高瓊脂量的培養(yǎng)基，可以在實(shí)驗(yàn)室中，按每100mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（脫水干粉培養(yǎng)基）中加入1g的瓊脂，再高壓滅菌，倒平板備用。
在較高瓊脂量的培養(yǎng)基上再純化的原因：因?yàn)榫暝诃傊枯^高的培養(yǎng)基上莢膜發(fā)育不良，可以暴漏出O抗原，有利于檢測是否有菌體抗原存在；- II.若是因?yàn)橛?/span>Vi抗原存在而阻止O凝集反應(yīng)時(shí)，可多挑取純化后的待測菌株置于1mL生理鹽水中制成濃菌液，煮沸，破壞莢膜的多糖和抗原，暴露O抗原，需要待菌液冷卻后再進(jìn)行O多價(jià)血清的鑒定。
但H抗原發(fā)育不良時(shí)，H多價(jià)血清也會不凝集，此時(shí)需要將菌株接種瓊脂量更低（0.55%-0.65%）的半固體瓊脂平板中央，培養(yǎng)后，菌株蔓延生長至平板的邊緣時(shí)，取最邊緣的菌株進(jìn)行H多價(jià)血清凝集試驗(yàn)；注意 若培養(yǎng)后菌株未蔓延生長，則需要再次轉(zhuǎn)種半固體瓊脂培養(yǎng)基，直至蔓延生長；為什么H多價(jià)血清鑒定需要瓊脂量更低的半固體瓊脂平板？因?yàn)?/span>H多價(jià)血清的鑒定需要菌株的鞭毛發(fā)育良好，而培養(yǎng)基的瓊脂量更低時(shí)，含有的水分就越多，越有利于菌株鞭毛的發(fā)育和爬行。促進(jìn)鞭毛發(fā)育的另一種方法是將菌株通過接種裝有0.3%-0.4%半固體瓊脂的小玻管1-2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查，該方法操作較復(fù)雜。綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。注意 報(bào)告結(jié)果不能只參考生化試驗(yàn)或血清學(xué)鑒定的結(jié)果，而應(yīng)該綜合考慮生化和血清學(xué)兩項(xiàng)的共同結(jié)果來判斷。
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