解答：（1）梯度洗脫是指在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，達到有效分離的洗脫方式。梯度洗脫一般采用二元流動相，通常為水相和有機相。

（2）梯度洗脫時流動相通常由多種不同極性的溶劑組成。梯度洗脫主要原理是通過調(diào)整不同時間段流動相的極性來調(diào)節(jié)各個組分的容量因子κ，使得在合適的時間范圍內(nèi)將各個組分的保留合理分配，最終實現(xiàn)最佳分離。

解答：（1）流動相的pH值主要是影響到分配系數(shù)而導(dǎo)致各組分出峰時間的不同。

（2）除此之外，影響出峰時間的因素還有很多，從分配系數(shù)、容量因子等各個方面考慮，除了與目標化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)有關(guān)，還與流速，壓力，柱溫等液相色譜儀參數(shù)有關(guān)，具體涉及下面幾種因素的影響：

a.目標化合物本身，具體包括分子量、結(jié)構(gòu)、化合物類型、極性等；

b.流動相，具體包括流動相構(gòu)成、配比、流動相各組分極性，洗脫方式，流速等；

c.固定相，具體包括固定相種類、結(jié)構(gòu)、色譜柱長度等；

d.分配系數(shù)與容量因子，具體包括化合物在流動相與固定相之間的分配情況，柱溫等。

問題描述：用液相色譜做某物質(zhì)含量測定時，保留時間太長，20min左右才出峰，有沒什么方法可以將保留時間提前？

解答：可以從通過改變目標組分容量因子k、縮短柱長、增加柱溫等方式將保留時間提前，具體可以采取以下方法：

（1）調(diào)整流動相，具體包括調(diào)整流動相構(gòu)成、配比、流動相各組分極性、洗脫方式、提高流速等。

（2）調(diào)整固定相，具體包括固定相種類、結(jié)構(gòu)、縮短色譜柱長度等。

（3）增加柱溫，降低流動相傳質(zhì)阻力等。

解答：（1）容量因子指在一定溫度和壓力下組分在兩相中分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。容量因子反映了組分在柱中的遷移速率，又稱作分配比，用符號κ表示。

（2）容量因子的具體計算公式見式（1-19）。需要注意的是，容量因子與分配系數(shù)不同，容量因子除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t’R、tm較Vs、Vm易于測定，所以容量因子應(yīng)用更廣泛。

問題描述：采用C18柱測定黃酮苷，用甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流動相，分離效果不理想，想通過延長保留時間的方式提高分離度，具體應(yīng)該如何操作？

解答：（1）甲醇+乙腈+四氫呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流動相，流動相的pH值可能會超過色譜柱的耐受范圍，因此不建議使用。建議直接使用甲醇-水或是乙腈-水作為流動相，水相中可以適當(dāng)加點甲酸或是乙酸來得到最佳分離效果。

（2）通?？梢酝ㄟ^降低流速、減小有機相比例、調(diào)節(jié)流動相pH值或更換較長的色譜柱等方式延長待測組分的保留時間，從而達到提高組分之間分離度的目的。

問題描述：采用高效液相色譜分析苯甲酸時，流動相走了很久，進樣以后保留時間還是不斷漂移，是什么原因造成的？

解答：保留時間一直在變，說明系統(tǒng)沒有平衡好，可以從多個方面去排查原因。

（1）流動相可能是最主要的原因，流動相平衡時間是否充足、管路有沒有氣泡、流動相中有機相是否蒸發(fā)、比例閥工作是否正常。

（2）泵有可能存在問題，輸液是否正常、壓力是否穩(wěn)定、泵密封墊是否完好、是否有漏點。

（3）色譜柱也需要排查，是否恒溫、是否有漏液。

解答：（1）當(dāng)色譜柱中僅有流動相通過時，檢測器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線。

（2）穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條接近于水平的直線，反應(yīng)的是隨著時間變化的檢測器系統(tǒng)噪聲值。

解答：（1）分離度是衡量色譜柱分離效果的指標，它表示相鄰組分色譜峰的分離情況，具體為相鄰組分色譜峰保留值tRI，tRII之差與兩峰寬WI，WII平均寬度之比，用符號R表示。

（2）兩峰間距離越大，兩峰越窄，R值就越大，分離的就越好。當(dāng)R=1時，兩色譜峰交疊約4%，可稱為基本分離；當(dāng)R=1.5時，兩色譜峰交疊約0.3%，可視為相鄰兩組分完全分離。

（3）分離度要求大于1.5，那就是說要求兩種組分完全分離。

問題描述：什么是檢出限？什么是定量限？兩者有什么區(qū)別？

解答：（1）兩者的定義如下：

a.檢出限（LOD，Limit of Detection）：分析方法在規(guī)定實驗條件下所能檢出被測組分的最低濃度或最低量；

b.定量限（LOQ，Limit of Quantification）：分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度或最低量。

（2）兩者的區(qū)別如下：

a.檢出限指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

b.定量限指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準確度和精密度要求。

c.檢出限或定量限的測定通常是在目標物的含量接近于“零”的時候才需要進行測定。當(dāng)方法應(yīng)用于所測定的分析物濃度要比定量限大的多時，檢出限與定量限評定就顯的不是非常有必要了。但是對于那些濃度接近于檢出限與定量限的痕量和超痕量測試，常報出“未檢出”時，這時檢出限或定量限對于風(fēng)險評估或法規(guī)決策則就顯得非常的重要。

d.不同的基體需要獨立評估其檢出限和定量限。

e.通常3倍信噪比是檢出限，10倍信噪比是定量限，但是不同的領(lǐng)域有不同的規(guī)定，測定檢出限和定量限的方法也不一樣。

問題描述：如何獲得檢出限？有沒有參考標準？

解答：（1）可用多種方式獲得檢出限，下面羅列了一些常見的獲得檢出限的方法。

a.基于虛擬（Visual）評估LOD：

Visual評估可應(yīng)用于非儀器方法和儀器分析方法，同時也可應(yīng)用于定性測試方法的評估。通過往樣品空白中添加已經(jīng)濃度待測物質(zhì)進行分析，評定能夠可靠被檢測出的最低濃度值。

在樣品空白中加入一系列不同濃度的分析物，在每一個濃度點需要進行約7次的獨立測試。各個濃度點的重復(fù)性測試應(yīng)該隨機。對于定性分析，通過繪制陽性百分比（陰性）與濃度之間的響應(yīng)曲線，檢查確定哪個濃度閾值是不可靠的。

b.空白標準偏差進行評定LOD

通過分析大量的空白進行評定（推薦20個以上）。樣品空白獨立測試的次數(shù)（n大于10以上），以及加入最低可接受濃度的樣品空白測試次數(shù)（n大于10次以上）。LOD的評定可用樣品空白平均值加上3倍標準偏差。

c.基于校準曲線的LOD評定

如果LOD數(shù)據(jù)或與LOD相近的數(shù)據(jù)無法得到，則可利用校準曲線的參數(shù)進行評估。用空白加上空白的3倍偏差，儀器對于空白的響應(yīng)可用方程截距a表示，儀器響應(yīng)的標準偏差可用校準曲線的標準偏差Sy/x來表示。故可利用方程yLOD=a+3Sy/x=a+bxLOD，則xLOD=3Sy/x/b。這個方程廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)。然而由于這是推斷，當(dāng)濃度接近于期望LOD時，則所測定的數(shù)據(jù)就會顯得不那么可靠，建議當(dāng)濃度接近于LOD時，需要證明要在合適的置信區(qū)間內(nèi)能夠被測定出來（可靠地被測定出來）。

d.基于信噪比LOD

由于儀器分析過程都會有背景噪聲，常用的方法就是利用已經(jīng)低濃度的分析物與空白樣品的測量信號進行比較，確定出能夠可靠測定出的最小濃度，最典型的可接受的信噪比是2：1或3：1。

（2）不同領(lǐng)域，獲得檢出限的依據(jù)不一樣，下面羅列了部分參考依據(jù)。

a.GB/T 27417-2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》；

b.JJG 705-2014《液相色譜儀》；

c.HJ 168-2010《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標準制修訂技術(shù)導(dǎo)則》；

d.GBZ/T 210.4-2008《職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南 第4部分：工作場所空氣中化學(xué)物質(zhì)的測定方法》。