2.對已確認(rèn)方法的驗收（Verification for previously validated methods）對于像ASTM,US EPA,ISO和IP這些已通過合作研究(collaborative studies)進(jìn)行確認(rèn)的方法，且能夠適用于方法所要求的范圍之內(nèi)，對于這類的方法則不需要向內(nèi)部方法（in-house method）那樣的嚴(yán)格驗證，同樣適用于出版的帶有實驗數(shù)據(jù)的科學(xué)文獻(xiàn)。鑒于此，對于使用這些方法的實驗室，大體上能夠驗證（verify）操作者按照方法中要求操作且能夠獲得相同的結(jié)果即可。方法的驗收（verification of method）必須包括對現(xiàn)有已驗證方法使用前所進(jìn)行統(tǒng)計糾正(statistical correlation)。 但需要注意的是，由于不同標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)或公認(rèn)的技術(shù)組織對于方法標(biāo)準(zhǔn)的文件化（documentation）差異，如果組織在所發(fā)布的方法中沒有驗證報告或缺乏部分性能(performance characteristics)或僅對部分性能確認(rèn)（verify），則實驗室不能夠直接使用方法，需要確認(rèn)。 在使用條件下的方法驗收不僅僅是要驗收體系符合于方法的要求，同樣也驗收了方法準(zhǔn)確度、精確度或其它參數(shù)的符合性。常用以下方式證明方法性能（method performance）： l l l l l l 如對原內(nèi)部方法（in-house method）做了微小的改變（換成不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的色譜柱，選擇不同的生長基質(zhì)等），則也需要對方法做驗收。 驗收程序中關(guān)鍵參數(shù)依賴于方法的性質(zhì)和所可能遇到樣品的類型。足夠用于統(tǒng)計分析數(shù)量的樣品，樣品濃度類型需要涵蓋所要評定/測定結(jié)果范圍之內(nèi)。對于定量分 析，至少評定方法偏差和測量精密度，痕量分析則需要考慮方法檢出限LOD和LOQ，以確定滿足需求。定性方法，對現(xiàn)有已確認(rèn)方法或與已經(jīng)結(jié)果對比進(jìn)行糾正 研究（correlation studies）是需要的。 如果一個機(jī)構(gòu)要對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行重大的修改，則需要全面的驗證。當(dāng)然，難以確定哪些因素的改變會導(dǎo)致重大的變化，除非標(biāo)準(zhǔn)中有說明哪些修改會影響測試結(jié)果。 但是一般以下幾種情形，可視作為重大改變，如使用不同的溶劑、使用HPLC代替GLC、不同的介質(zhì)、影響繁殖的關(guān)鍵溫度或時間。 如果客戶需要比已確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)更加詳細(xì)的說明，則需要附加的確認(rèn)。 3. 方法確認(rèn)和確認(rèn)參數(shù)非標(biāo)準(zhǔn)方法和內(nèi)部開發(fā)方法需要方法確認(rèn)。方法性能基于方法的有意使用（intended use）。如果一個方法用于定性分析，那么就不需要對在設(shè)備整個動態(tài)范圍內(nèi)確認(rèn)方法的線性。 在進(jìn)行驗證之前應(yīng)對方法范圍和確認(rèn)準(zhǔn)則進(jìn)行界定和文件化。這些包括但不局限于以下問題：
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h) 以下工具用于證明有能力滿足方法性能的具體要求：
1.
2.
3.
4.
5.
6. 比對確認(rèn)（Comparative validation）比對確認(rèn)（糾正或交叉）常用于生物分析和用于證明使用兩個或以上方面測定某些測量參數(shù)是否一致（equivalent）。如果用原已驗證的方法作為參考，將修規(guī)后的方法與其進(jìn)行比對。 不存在僅有單一個測試就能評估方法一致性或可接受準(zhǔn)則。一般將靈敏度高或高回收率的方法認(rèn)為是最好的。為了證明替代方法（alternative method mean）與參考方法之間是沒有統(tǒng)計學(xué)差異（顯著性差異），則可以利用配對t-test檢驗分析變異性和結(jié)果差異性。定性方法的比對確認(rèn)研究，可包括對操作性能的鑒定（identification）（靈敏度、選擇性、假定假陽性和假定假陰性）。 確認(rèn)研究可利用外部機(jī)構(gòu)的一些附加技術(shù)研究做支持，考慮利用能力驗證的數(shù)據(jù)。 當(dāng)單一研究（a simple study）要在不同地點或不同機(jī)構(gòu)進(jìn)行時，每一個地點或機(jī)構(gòu)需要利用加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和subject samples進(jìn)行交叉驗證確保實驗室內(nèi)（inter-laboratory）的可靠性。同樣，也可考慮使用不同分析技術(shù)的比對實驗（如LC-MS-MS與ELISA）。 初步確認(rèn)Primary validation對于比對驗證無法使用的情況下（如內(nèi)部開發(fā)方法，修改的標(biāo)準(zhǔn)方法可影響最終測試結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)方法超出了其使用范圍，可替代分離或檢測原理使用、以及快速分析 方法），則在導(dǎo)入方法之前，必須要進(jìn)行方法初步確認(rèn)。此時，確認(rèn)成為了確認(rèn)一個替代、新穎或其它獨立特點方法的操作局限性和性能為目的的探索性工作。會對 方法的性能做出大量和/或表示性的說明。 第一步界定要鑒定或測量對象；包括定性表示要測定的實體（entity）和定量（如可能的話）。然后對規(guī)則（說明）和客戶的任何要求進(jìn)行確認(rèn)方法。 第二步選擇某些性能參數(shù)(Performance Parameters)進(jìn)行測定。在后續(xù)表述。注意：不同的國家或國際委員會組織對這些參數(shù)的定義不盡相同。本文件所使用的定義來源于國際測試術(shù)語 （VIM）(JCGM200,2008)。在很多情況下，這些術(shù)語替代了其它的組織的定義。但是，一些解釋說明應(yīng)要與其領(lǐng)域相關(guān)。 由于在不同的領(lǐng)域，性能參數(shù)測試所需要的樣品量也不同，但必須要保證足夠的量保證實現(xiàn)方法結(jié)果統(tǒng)計有效性（statistically valid），如夠用于t-test（t檢驗）評定準(zhǔn)確性。推薦每一個基體中每一個濃度點的每個測試要至少重復(fù)7次測定。實際操作上，這些數(shù)量都會超過。一般而言，越多的樣品測試，越大的自由度，對于測量的統(tǒng)計學(xué)分析就越可信。 基體變化（matrix variation）在許多方面是最為重要的因素但是也是測試誤差中最難以把握一個因素。因此，重要的是考慮樣品物質(zhì)性質(zhì)引起了基體變化。就某一些程序而 言，如LC-MS-MS基本程序，采用合適的措施確保在整個方法過程中降低基體影響，特別是基體的性質(zhì)在方法確認(rèn)過程中的變化（FDA,2001）。 方法分析的每一步要調(diào)查這些環(huán)境的，基體，材料或程序變化，在物質(zhì)收集過程和分析過程中對基體中分析物測定的影響。對于方法確認(rèn)除了后續(xù)所列的那些參數(shù)之 外，同樣也要考慮對評定分析物的穩(wěn)定性。如許多溶質(zhì)在色譜分析前易分解，可能發(fā)生在溶液制備、萃取、凈化、相轉(zhuǎn)移或存放在冰箱的管瓶中或自動進(jìn)樣器。必須 要在樣品收集和處理過程，長期或短期貯存，經(jīng)過循環(huán)的冷凍和融化以及處理工程中，考慮到樣品分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性實驗考察試驗的條件要與實際樣品處理和 分析的條件一致，同樣也要對儲備液中分析物穩(wěn)定性做評定。 以下是一個方法確認(rèn)中關(guān)于罐裝水果中Sn元素穩(wěn)定性的分析的例子： 例子： 標(biāo)準(zhǔn)溶液中Sn：準(zhǔn)備一個新的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線，與之前配制儲存的溶液進(jìn)行比對，以分析在標(biāo)準(zhǔn)溶液中Sn在一段內(nèi)的穩(wěn)定情況。 基體中Sn：在典型的儲存條件下，對于水果中的Sn要多次的分析，使用ICP-OES測定其Sn含量是否降低或消失。 消解溶液中Sn：對含有已經(jīng)濃度值的水果樣品進(jìn)行消解，并在一周內(nèi)每日測定。 方法確認(rèn)參數(shù)（Performance Parameters）3.1 線性范圍Range in which the calibration equation applies (linearity of calibration)線性用于表達(dá)某個給定參數(shù)濃度與其信號（響應(yīng)）之間比例關(guān)系。利用校準(zhǔn)方程度量線性，因此只是涉及到儀器測量。線性分析同樣利用與整個方法，故也用于考察分析物濃度正確度（trueness）的方程。 對于儀器分析，推薦通過以下的草案（方案）（Thompson etal.2002,LGC,2003）將校準(zhǔn)曲線模型的驗證作為方法確認(rèn)的一部分。 l l l l 響應(yīng)值與濃度之間的斜率可以快速地表示出現(xiàn)兩者之間的關(guān)系。經(jīng)典的最小二次擬合方程y = a + bx（y，儀器響應(yīng)值；x,濃度值）常用于測試分析，a,為線性擬合的截距；b,線性擬合方程的斜率）擬合的標(biāo)準(zhǔn)方差(the standard error) sy/x用來評判擬合是否良好。通常使用線性擬合相關(guān)系數(shù)來表示（correlating coefficient），但要注意這種容易產(chǎn)生誤導(dǎo)，有不同的爭論。殘差用于評估非線性。繪制擬合數(shù)據(jù)和殘差圖表用于證實線性和離群檢驗。如果重復(fù)方差與濃度成比例，則會選用加權(quán)擬合（weighted regression）而不是經(jīng)典最小二乘法。 在標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時，統(tǒng)計方法非常的有用，如ICP-OES和ICP-MS的二次擬合方程。例如在Hibbert(2005)在論證測量不確定度與其參數(shù)是否呈線性關(guān)系時，采用的二次校準(zhǔn)方程。 如果在所考查的濃度范圍之內(nèi)不能呈現(xiàn)所期待的線性關(guān)系，則應(yīng)設(shè)法消除導(dǎo)致線性差的因素，或者限制（縮小）濃度的范圍以確保其線性。在某些情況下，即便非線 性方程是適合的，但也要謹(jǐn)慎使用，需要驗證所選用這種模型的可行性。一般而言，標(biāo)準(zhǔn)曲線僅需要對樣品中可能涉及的分析物濃度的范圍便可，曲線的標(biāo)準(zhǔn)濃度范 圍過寬并不是件好事，因為其測量的不確定度隨著濃度范圍變廣而增加。 校準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)可以用于評估精密度（實際上，sy/x用于y的重復(fù)性，sy/x/b用于濃度x的評估。要計算精密度，曲線要準(zhǔn)備至少3條。（譯者注：可準(zhǔn)備一定數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)溶液，后對每個濃度點測定3次。） 注意，從數(shù)據(jù)上可計算出定量限（LoQ）。 對于非儀器的測試分析，可通過選擇不同濃度點（低，中，高濃度）的標(biāo)準(zhǔn)溶液測定線性。最低濃度點應(yīng)接近于檢出限，中濃度和高濃度分別是？？（原文：The lowest level should fall at approximately the limit of detection, the edium and high levels one and two levels higher respectively），可在中和高濃度間加入中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，則可提高準(zhǔn)確性。將結(jié)果繪制成“響應(yīng)曲線”。 3.1.1 測量區(qū)間/范圍Measuring interval測量范圍正常是源于線性的研究。測量范圍是定義為分析物在其上下限濃度范圍之間能夠滿足一定準(zhǔn)確度、精密度、線性要求等（如可接受的不確定），而這個上下限的濃度范圍叫為測量范圍。實際上，可接受的不確定通常是在高于上限濃度而評估獲得的（超過了線性范圍） 然而需要非常小心的考慮確認(rèn)濃度范圍，如在LOQ和最高濃度之間的確認(rèn)。 注意：在一些場合，數(shù)據(jù)測量范圍也被稱為工作范圍。（ “工作區(qū)間working interval”, “工作范圍working range”, “測量范圍measuring range”, 或“測量范圍measurement range”.） 3.1.2 基體影響 Matrix effects一旦工作曲線的范圍已經(jīng)被確定之后，那么必須確定基體對分析物回收性能的影響。從原則上，一個樣品中不只含有待測物一種物質(zhì)，同樣含有其他成分（外來物 質(zhì)，共生物質(zhì)等），樣品中這些成分構(gòu)成的存在對結(jié)果有潛在性影響，提高或降低設(shè)備檢測器對待測物的響應(yīng)值?；w對強(qiáng)度和存在（occurrence）中產(chǎn) 生不利影響，一些技術(shù)容易受到影響，因此，有些干擾物會使得分析物的回收變得很差，甚至從100%到一個很大的數(shù)。例如，在用氣、液色譜測定農(nóng)殘分析時， 通常可知基體的存在使得強(qiáng)度增強(qiáng)。在一些復(fù)雜樣品或不明的基體，如食品，是很難評估基體對分析的影響。 如不存在基體干擾，則用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制溶液更好。而如果懷疑存在基體干擾，則需要通過在典型樣品萃取液中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行識別。每種基體類型溶液中準(zhǔn)備3個濃度點，并至少重復(fù)測定1或2次。 為了測定基體對儀器響應(yīng)的影響，配制校準(zhǔn)曲線時，加入基體配制的校準(zhǔn)曲線的溶液濃度點應(yīng)與不含有基體的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度一致，這樣可以考察這兩個曲線斜率是否 存在顯著性差異，如果小于10%，則認(rèn)為不需要對基體影響進(jìn)行修正。然而，需要注意標(biāo)準(zhǔn)加入法不能對所添加基體的影響進(jìn)行彌補（消除）。至于非儀器分析方 法，可通過3.4.3節(jié)回收（recovery）對是否存在基體干擾進(jìn)行確認(rèn)。 如果基體添加標(biāo)準(zhǔn)（matrix fortified standards）測出的結(jié)果要較純標(biāo)準(zhǔn)物測出（全過程）的結(jié)果要高或低。這些結(jié)果由于目標(biāo)物在基體物質(zhì)中回收率低，或存在干擾導(dǎo)致高回收率，可能因為 基體的存在抑制或提高儀器檢測器的響應(yīng)。為確認(rèn)這些可能性，機(jī)構(gòu)可通過單純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、用于分析全過程的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、在空白基體溶液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、在萃取前加 入到基體中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所取得的結(jié)果進(jìn)行比對。然后，進(jìn)行以下測定： l l l 3.2 選擇性在方法確認(rèn)過程中，它是在確定所測定的方法滿足有意測定（intended to measure）要求重要的參數(shù)。另外，方法應(yīng)不受到干擾，否則可能產(chǎn)生錯誤結(jié)果。方法選擇性確保在有干擾物的存在情況下能實現(xiàn)測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，如存在競爭性非目標(biāo)微生物、雜質(zhì)、降解物和基體成分。術(shù)語“選擇性”和“專一性”（specific）經(jīng)常被交替使用。 “專一性”一般是指方法能對目標(biāo)物產(chǎn)生單獨的響應(yīng)。而選擇性是指方法能對許多實體產(chǎn)生響應(yīng)，這些實體能或不能之間區(qū)別開來。由于極少有方法僅對目標(biāo)物有響應(yīng)，因此對于選擇性術(shù)語的使用會更適合。 對于高度專一性測定程序的方法（如色譜/質(zhì)譜）具有很好的選擇性。然而，對于比色法，目標(biāo)物的顯色常會受到性質(zhì)相同或有色共萃取物的影響。由于分析者要確定所有潛在的干擾物是非常不實際的，分析員需要利用知識和經(jīng)驗考慮那些最相關(guān)性的情況。 如果有需要考察潛在干擾物的影響，通過加入已知濃度的可疑干擾物進(jìn)行分析。這種測試對含有一定濃度的目標(biāo)物的樣品中進(jìn)行，且涉及的濃度范圍應(yīng)包括實際樣品 中可能會碰到的濃度值（單個濃度點測試可接受，也可測定含有多種不同濃度的干擾物的樣品。）如果一個方法要定量多種目標(biāo)物，則需要測定這些分析對象間是沒 有互相干擾的。需要考察干擾物的影響——是否干擾物提高或抑制測定物質(zhì)的定量檢測？原則上，所開發(fā)方法具有一定級別的選擇性而無大干擾。如果定量或測定受 到干擾物的阻礙，則需要進(jìn)一步的方法開發(fā)。但是小的影響是可以容許的，包括在偏差的評估中。 方法需要進(jìn)行證實（confirmation），如韓鷗低濃度的有機(jī)化合物的樣品（食品中農(nóng)殘和有機(jī)污染物），需要對微量有機(jī)物進(jìn)行陽性定性（positive identification）.確認(rèn)適用于殘余物的定性和濃度分析。對于陽性樣品的濃度與定性的確認(rèn)，可通過不同檢測方法或柱子或使用專用的質(zhì)譜或其他可選擇的分析方法進(jìn)行確認(rèn)（如NDA序列分析和凝膠電泳）。這種情況下必須執(zhí)行證實技術(shù)的確認(rèn)。 3.3 靈敏性（sensitivity）方法靈敏性是指隨著分析物濃度的變化而引起響應(yīng)值的變化，它是響應(yīng)曲線的有效梯度。靈敏度越大通常認(rèn)為更小的（線性）動態(tài)范圍和低測量不確定度。對于儀器分析，靈敏度可以用校準(zhǔn)工作曲線y = a + bx 中的斜率b來表示，利用經(jīng)典最小二乘法線性擬合進(jìn)行計算，也有經(jīng)驗性方法，對含有多種不同濃度分析物的樣品進(jìn)行測定。靈敏度可通過分析樣品萃取液中的添加 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定。當(dāng)平均斜率>1或<-1時，則表明為高靈敏性。高靈敏度表明方法在分析物含量在微小變化下就能感應(yīng)的到。但高靈敏度同時也 意味著低動態(tài)線性范圍。如果靈敏度隨著每天的操作環(huán)境發(fā)生變化，則這種方法在所期望的濃度范圍就難以獲得滿意、線性的響應(yīng)。靈敏度的確認(rèn)將作為機(jī)構(gòu)正常進(jìn) 行質(zhì)量保證和控制程序中一部分。 3.4 準(zhǔn)確性Accuracy準(zhǔn)確性是單個測量結(jié)果的一個性質(zhì)，受到隨機(jī)和系統(tǒng)誤差所影響的。因此其本身不包括在方法確認(rèn)中。準(zhǔn)確度表示結(jié)果與真值之間的接近程度，因而其包括了精密度和正確度（偏差來表示）。 精密度與測量的重復(fù)性和再現(xiàn)性條件相關(guān)，“表示每次重復(fù)性測定獲得相同結(jié)果的一致性。換句話說，精密度就是多個測量結(jié)果之間的一致性。重復(fù)性是指多次測量結(jié)果的分散性，主要受到隨機(jī)誤差的影響，它不是表明結(jié)果與真值間的接近程度。 一個測量系統(tǒng)可準(zhǔn)確不精確、精確不準(zhǔn)確、或者既不準(zhǔn)確也不精確。如果一個測量系統(tǒng)中存在系統(tǒng)誤差，增加測量次數(shù)可以提高測試精密度，但無法提高準(zhǔn)確性。消 除系統(tǒng)誤差可提高準(zhǔn)確度但不能改變精密度。然而，測量體系的有效性是指其是否滿足“目的的適應(yīng)性”，因此需要按照確認(rèn)準(zhǔn)則對準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行評估。這是 沒有絕度衡量標(biāo)尺（there is no absolute scale.）。 我們無法獲得完全的測量，理想的測量在有限的測量儀器下盡可能接近真值。 以下圖解用于說明兩個術(shù)語，準(zhǔn)確度和精密度之間的區(qū)別。
A.既準(zhǔn)確又精確 3.4.1精密度（ Precision）ISO 3534-1(2006)表述了精密度作為在重復(fù)性條件下（重復(fù)性、中密度、再現(xiàn)性條件下）獲得多個獨立結(jié)果之間接近程度（分散程度）。要獲得怎樣程度的 精密度主要依賴于這種測試的作用與重要性。注意“獨立測試結(jié)果是指結(jié)果是在不受到以前同樣或類似樣品測試結(jié)果的影響，這些樣品應(yīng)該獨立準(zhǔn)備，可認(rèn)為是在總 體樣品中隨機(jī)樣品。 精密度在數(shù)學(xué)上通常用測量不精密度的來表達(dá)，如多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，精密度越低）或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）。也可用其他合適的方式表達(dá)。 為了要獲得正常操作條件下方法的精密度，則測試必須在同樣條件下進(jìn)行，測試樣品為正常分析的典型樣品，樣品準(zhǔn)備要與正常操作一致，試劑、測試設(shè)備、分析人 員和操作均要實際測試的情況一致。樣品要均勻，否者如果無法獲得均質(zhì)材料需要通過認(rèn)為準(zhǔn)備或樣品溶液進(jìn)行評定其準(zhǔn)確性。 精密度會隨著分析物濃度的變化而變化。如果分析物的濃度超過平均值的50%則需要對精密度進(jìn)行評定。對于某些測試，可能只對數(shù)據(jù)使用者的特別顯著的一個或兩個濃度進(jìn)行評定，如產(chǎn)品質(zhì)量控制（QC）或法規(guī)限值。 對于單一實驗室的方法確認(rèn)，測量精密度的最好的方式就是對實驗室的某一個樣品的多個部位和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM）或參考物質(zhì)（RM）在正常條件下進(jìn)行長期 測定。通常包括以下表述的實驗室間再現(xiàn)性的測定（再現(xiàn)性條件），在不同樣品、不同時間進(jìn)行，且數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，則這些數(shù)據(jù)將結(jié)合用于計算合并 （pooled）標(biāo)準(zhǔn)偏差。 主要注意的是，上述關(guān)于精密度的闡述都是相對于定量分析而言的。定性分析則可以用稍微不同的方式來處理。在一個界定的被分析物濃度閾值水平上，定性分析是 一種有效的是或否。對于定性方法來說，精密度不能用標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對偏差來表示，而是用真陽性(或陰性)的比率來表示，真陽性在所有陽性（包括真陽性和假陽 性）的占有比例。這些比率的測定應(yīng)該在不同的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，包括低于閾值的濃度、在閾值范圍水平上的濃度以及高于閾值的濃度水平。 精密度=真陽性的數(shù)量/(真陽性數(shù)量和假陽性數(shù)量)*100% 可利用F檢驗統(tǒng)計法對兩個方法的精密度進(jìn)行顯著性檢驗。 對于精密度，測量的重復(fù)性和再現(xiàn)性常作為其量度。重復(fù)性和再現(xiàn)性在分析方法內(nèi)的測量濃度不同而不同，因而需要在多個濃度點進(jìn)行測定，其中一個濃度點應(yīng)包含測試范圍內(nèi)最低濃度。對于可疑基體產(chǎn)生的影響，測定多個濃度點顯得尤為必要。 3.4.1.1 重復(fù)性重復(fù)性是在重復(fù)性條件下的精密度。重復(fù)性是指一個機(jī)構(gòu)用相同的方法在同一個實驗室由相同的操作人員在短時間內(nèi)用相同的設(shè)備測得的相互獨立的測試結(jié)果。（條 件盡可能一致，如溫度、加熱溫度）。在合適的測試次數(shù)，可用標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），方差（s2）等表示。如果方法中涉及到儀器分析，則除了方法重復(fù)性外還要有儀 器重復(fù)性。重復(fù)性是體現(xiàn)了測量結(jié)果短期變異，同樣也是用于評定在單一批次分析中重復(fù)測定可能存在的差異。然而，其低估了在長期正常條件下測量結(jié)果的分散 性。 重復(fù)性的測定，要在自由度至少在6下測定。如在一系列（series）測試一個樣品（item）測定7次，或2個樣品，每個系列測定4次；3個樣品，每個系列3次。 儀器重復(fù)性可通過對校準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)溶液進(jìn)樣測定7次，后計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差。進(jìn)樣應(yīng)是在隨機(jī)性下進(jìn)行以降低偏差。 方法重復(fù)性通過準(zhǔn)備含有不同濃度分析的共用（pool）樣品或濃度相近的用于方法回收率研究的樣品進(jìn)行測定，亦可使用在加了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白溶液中進(jìn)行測定。制備多個加了標(biāo)的萃取液在同一天內(nèi)由同一個分析員進(jìn)行分析。計算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。 3.4.1.2 再現(xiàn)性(reproducibility)再現(xiàn)性是指在多個條件變化下進(jìn)行一系列測定出的結(jié)果的精密度評估。如使用同種方法測定相同項目，但由不同操作員在不同機(jī)構(gòu)、不同設(shè)備、不同時間內(nèi)的測定。 可表示為標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），方差（s2），概率分布系數(shù)，例如在利用兩種以上校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液在一段時間、測定一定數(shù)量的試樣。對于單個實驗室通常使用實驗室內(nèi) 再現(xiàn)性、實驗室間的再現(xiàn)性或中密度精密度這些術(shù)語來表示相關(guān)的再現(xiàn)性精密度，這些條件包括在不同時間內(nèi)測定，在與日常使用方法中條件差別盡可能小的情況下 測定（如不同分析員利用不同設(shè)備的測試）。 再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可通過一系列多個樣品獲得，或多個系列測定結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計算。測試的自由度可通過系列量和每系列中樣品數(shù)量進(jìn)行計算。
如果測試方法是用于對一系列樣品類型進(jìn)行測定（如不同分析物濃度或樣品基體），則精密度的評估需要選擇每個類型代表性的樣品進(jìn)行測定。由于一個方法的精密度會隨著分析物濃度的降低而變得差。 3.4.2
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分析什么 |
從數(shù)據(jù)中計算什么 |
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a)10個獨立樣品空白，每個測量一次，或 |
a)樣品空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差“s” 或b）添加后的樣品空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差“s” |
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b)10個添加了最低可接受濃度的獨立樣品空白，每個測量一次 |
將a)樣品空白平均值+3s； 或b）0+3s對應(yīng)的被分析物濃度表示為LOD |
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該方法假定大于樣品空白值3s的信號來源于空白（背景）的遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1%，因此很可能來自其他地方，如被測量物。方法a)僅在樣品空白給出非零標(biāo)準(zhǔn)偏差是適用。得到真正的樣品空白可能很困難。 |
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c) 10個添加了最低可接受濃度的獨立樣品空白，每個測量一次 |
添加后的樣品空白測量值標(biāo)準(zhǔn)偏差“s”，用樣品空白平均值+4.65s（來源于假定檢驗）對應(yīng)的被分析物濃度表示LOD. |
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“最低可接受濃度“是指可以獲得可接受程度的不確定度的最低濃度 假定通常分別評估樣品和空白，并且將樣品信號對應(yīng)的被分析物濃度減去空白樣品信號對應(yīng)的濃度來進(jìn)行空白修正。 |
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例子（以下的實際測量數(shù)不與上述一致，僅供參考）：
離子選擇電極測定氨氮含量AMMONIA BY ION SELECTIVE ELECTRODE (ISE) （quoted ：ANALYTICAL DETECTION LIMIT GUIDANCE & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits，Wisconsin Department of Natural Resources Laboratory Certification Program，April 1996，PUBL-TS-056-96）
本例子介紹了用認(rèn)可的離子選擇性電極法測定氨氮的方法檢出限MDL.儀器生產(chǎn)商聲稱其儀器的可以檢出0.05 mg/L的氨氮含量. 使用3個標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 1, 5, and 10 mg/L 和空白。 將0.05 mg/L乘以5倍即 0.25 mg/L作為最初的“最低濃度值） (當(dāng)然選擇的濃度值可以在 0.05 ~0.25 mg/L之間). 結(jié)果列于表中，為計算MDL需要根據(jù)自由度，查表得出t值。對于本例自由度為6，t為 3.143（99%概率）。
TABLE I - AMMONIA
Sample
sample
1
sample 2
sample 3
sample 4
sample 5
sample 6
sample
7
Mean = 0.22 87.4%
Std Dev. = 0.013
MDL= (s)(t-value)= 0.013 x 3.143= 0.040859
修約為0.041mg/L
LOQ= 10 x (s)= 10 x 0.013= 0.13 mg/L
利用以下方面進(jìn)行確認(rèn)：
1. Spike Level (MDLx10>Spike): (0.041)(10) = 0.41 > 0.25 ug/L [OK, Meets Criteria]
2. Spike Level (MDL<Spike): 0.041
< 0.25 ug/L
3. MDL < Req'd? --- [No Requirement]
4. S/N Estimate (ave/sd): 0.22/0.013= 16.9 [Check for Error]（2.5-10）
5. Ave. % Recovery: 87.4% [Acceptable]
原文：
This example calculates the MDL for ammonia-nitrogen using the approved ion selective electrode method. The electrode's manufacturer claims that the probe can detect ammonia as low as 0.05 mg/L. The instrument was calibrated using three standards at 1, 5, and 10 mg/L and a blank. The first step, estimating the MDL, requires familiarity with the analytical procedure. In this case, the manufacturer's claim is a convenient place to start. Multiplying the manufacturer's number, 0.05 mg/L by a factor of 5 gives 0.25 mg/L for an initial spike level (the spike level could be anywhere between 0.05 to 0.25 mg/L). The ISE method requires 100 ml of sample per analysis. A stock standard was prepared by spiking reagent water at the appropriate concentration, and seven 100 ml aliquots were prepared and analyzed as prescribed in the method. The results for the study are shown in the Table I (in mg/L).
To calculate the MDL, simply multiply the sample standard deviation by the correct Student's
t-value from Appendix A.
TABLE I - AMMONIA
Sample
sample 1
sample 2
sample 3
sample 4
sample 5
sample
6
sample
7
Mean = 0.22 87.4%
Std Dev. = 0.013
For seven replicates and six degrees of freedom, t is found to be 3.143. The MDL is calculated as follows:
MDL= (s)(t-value)= 0.013 x 3.143= 0.040859
Rounding to the correct number of significant figures, the calculated MDL becomes 0.041
mg/L, slightly lower than the manufacturer's claim. The limit of quantitation can also be
calculated:
LOQ= 10 x (s)= 10 x 0.013= 0.13 mg/L
The MDL is now verified using the five point
check:
1. Spike Level (MDLx10>Spike): (0.041)(10) = 0.41 > 0.25 ug/L [OK, Meets Criteria]
2. Spike Level (MDL<Spike): 0.041 < 0.25 ug/L [OK, Meets Criteria]
3. MDL < Req'd? --- [No Requirement]
4. S/N Estimate (ave/sd): 0.22/0.013= 16.9 [Check for Error]
5. Ave. % Recovery: 87.4% [Acceptable]
方法耐變形（耐變形的量度）是在對實驗條件發(fā)生小變化情況結(jié)果不被影響的程度，研究方法條件變化對方法性能的響應(yīng)影響。如溫度、pH、試劑濃度、流動速 率。萃取時間、移動向組成。耐變形是指示方法在正常使用情況下的可靠性。耐變形是為了更好的確認(rèn)繼而控制那些能夠?qū)е聹y試結(jié)果變化的影響因素，以為更好的 提高方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。是通過對試驗中一些小、有意識變化的條件進(jìn)行設(shè)計考察耐變形。利用試驗空白、CRM、RM、已知組成試驗，以及進(jìn)行顯著性測驗 來評估耐變形。當(dāng)然，也可以從實驗室內(nèi)部方法開發(fā)、試驗時間再現(xiàn)性調(diào)查、方法性質(zhì)來評估出耐變形的影響因素。
耐變形的考察可通過對單個影響因素來分析，在其他因素不便下改變某個條件而重復(fù)測定評估對結(jié)果的影響（單個因子測試）。但是試驗中有大量的影響因素需要度量。因此實驗設(shè)計顯得相當(dāng)有必要，多個獨立因子同時考察。
實際上，一個實驗室人員有能力確認(rèn)那些對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響的因素如溫度極限值、時間或pH范圍，進(jìn)而采取措施控制這些影響。
表征合理的賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)(JCGM200, 2008)。測量不確定是測量結(jié)果的一個屬性，而不是方法的屬性。如果一個方法是在有足夠統(tǒng)計方法控制下的，那么一個典型測試結(jié)果的指示MU評估是可以被應(yīng)用。
在被要求對測量之間有效對比或結(jié)果與要求之間的比對時，MU的評定是必要的。
ISO/IEC 17025 and ISO 15189要求機(jī)構(gòu)在需要時所報出的結(jié)果中需要帶有不確定度。因此，不確定的評估可認(rèn)為是方法確認(rèn)中基本要求。關(guān)于不確定評估方法在大量參考資料有說明，因此在本文件中就不過多的累述MU的內(nèi)容。
ISO 已經(jīng)出版了MU的評估指引(ISO/IEC Guide 98-3, 2008) 和Eurachem/CITAC不確定及其應(yīng)用的說明文件 (Eurochem/CITAC, 2000). 。其它的資料有(UKAS, 2000; ILAC, 2002;APLAC, 2003; Magnusson et al., 2003; ISO/TS, 2004; Nordtest, 2005; Eurolab, 2007) ，網(wǎng)址www..
以上方法確認(rèn)因素方面所提到的信息可對測量不確定的估計起到很大的作用（但其它部分也必須要評價）。這些數(shù)據(jù)也可以以在相關(guān)方法下的日常QC和相關(guān)能力驗 證所取的結(jié)果作為補充。MU評估可基于或部分基于已經(jīng)發(fā)布數(shù)據(jù)或和專業(yè)判定（judgment）。就方法確認(rèn)方法，MU的評估應(yīng)是“目的適用性”。不確定 度評估要評估到何種程度需要根據(jù)測試的緣由來確定的。原則上評估應(yīng)滿足于測試的有意識目的的。合理性的不確定度評估可從考慮長期精密度（實驗室間再現(xiàn)性） 和偏差。例如，MU的重要貢獻(xiàn)參數(shù)，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和溯源性，以及可能被這些參量所覆蓋的因素都需要包含在評估中。
下列列出在對于方法確認(rèn)和驗證策劃實施中應(yīng)考慮到的各個性能參數(shù)，包括定性和定量方法。備注中同時也羅列了參數(shù)測定的一些方法。
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確認(rèn)Validation |
驗收Verification |
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待評定性能參數(shù) |
定量方法 |
定性方法 |
定量方法 |
定性方法 |
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LOD* and LOQ |
√ |
- |
√ |
- |
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靈敏度Sensitivity |
√ |
√ |
√ |
√ |
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選擇性Selectivity |
√ |
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√ |
√ |
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線性范圍 (linearity of calibration) |
√ |
- |
√ |
- |
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測量區(qū)間Measuring interval |
√ |
- |
√ |
- |
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基體影響Matrix effects |
√ |
√ |
√ |
√ |
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精密度（重復(fù)性和再現(xiàn)性）/準(zhǔn)確性Precision (repeatability and reproducibility) / Accuracy |
√ |
|
√ |
√ |
|
耐變性Ruggedness |
√ |
|
- |
- |
|
測量不確定度(MU) |
√ |
- |
(1) |
- |
*：被測物的濃度接近于“零”時需要；√：表示正常情況下需要的性能參數(shù)；-：表示正常情況下不需要；（1）：表示如果一個公認(rèn)測試方法中對不確定度的主要影響因素貢獻(xiàn)值和對結(jié)果的表達(dá)方式有要求，則機(jī)構(gòu)應(yīng)該滿足于ISO/IEC 17025或 ISO15189的要求。
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待評估的性能參數(shù) |
可遵照的程序 |
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檢出限LOD和定量限LOQ |
對濃度接近于零(graphical method)或兩倍于LOQ(statistical method)的分析物重復(fù)測定。使用空白和一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或含有低濃度目標(biāo)物的樣品。不同基體需要分別測試。 |
|
靈敏性Sensitivity |
對樣品溶液加標(biāo)分析，首先（initial）驗證響應(yīng)值對濃度校準(zhǔn)曲線的斜率（Plot）是否滿足要求。在初步核對之后需要更為很是的QC控制。 |
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選擇性Selectivity |
在含有或添加已知濃度的可疑干擾物的試劑和基體空白或標(biāo)準(zhǔn)或基體樣品的溶液（再工作范圍內(nèi)）中加入一定量目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行分析， |
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校準(zhǔn)曲線范圍（線性） (linearity of calibration) |
標(biāo)準(zhǔn)溶液能合理包涵樣品可能濃度范圍，并對其重復(fù)2次測定 |
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測量“間隔”Measuring interval |
偏差評價和可能LOQ測定 |
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基體影響Matrix effects |
分析基體空白或基體加標(biāo)（在每個基體類型中準(zhǔn)備3個濃度點，每個濃度點至少測1或2次） |
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正確度；偏差 |
對于與樣品基體和目標(biāo)物濃度相匹配的參考物質(zhì)（RM）進(jìn)行重復(fù)分析。 |
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精密度（重復(fù)性再現(xiàn)性）/準(zhǔn)確性Precision (repeatability and reproducibility) / Accuracy |
在一致條件下重復(fù)測定每種基體類型的樣品（如果可以應(yīng)選擇與測試數(shù)據(jù)使用方提供樣品分析物濃度最為相關(guān)的樣品），利用F-檢驗對比兩個方法的精密度。對于精密度，可將參考值與測定值進(jìn)行比較。 |
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耐變形Ruggedness |
在方法不能嚴(yán)格控制下，對可能影響結(jié)果的方法參數(shù)給予合適的限值。實施（根據(jù)必要性）: i) 單因子測試 (變化單個參數(shù)，并測定);ii)多因子測試 (Plackett-Burman實驗設(shè)計). |
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方法不確定度(MU) |
計算合理的，滿足目的適合性的不確定度確定所評估的不確定度，應(yīng)對與結(jié)果使用方的樣品濃度最為相關(guān)的結(jié)果不確定評估。 |
對于所有方法不是每一個性能指標(biāo)都要評估。至于方法確認(rèn)到什么程度？方法確認(rèn)應(yīng)足夠能確保實驗室能夠合理的結(jié)果和滿足客戶的需求這一基本原則。良好的方法 確認(rèn)研究策略應(yīng)是建立在對于在用方法具體要求清晰理解的基礎(chǔ)上。在這個框架之內(nèi)，良好設(shè)計實驗將提滿足供多個性能指標(biāo)的信息。
機(jī)構(gòu)需要做好方法驗證的綜合記錄，包括用于確認(rèn)、所獲得結(jié)果的程序，以及方法是否適用于目的的聲明。
機(jī)構(gòu)必須制定與方法確認(rèn)相關(guān)的文件以用于對分析方法滿足各個性能指標(biāo)值的可持續(xù)性檢驗。這可通過不斷實施內(nèi)部質(zhì)量控制跟蹤行為。假如方法無法測定出于之前方法評估相一致的結(jié)果，則這方法可能不再適用于測試目的。
通常，一個具體方法只能用部分樣品的分析，現(xiàn)在的問題是，對于這類的方法是否也需要向日常分析推薦使用的評定準(zhǔn)則那樣來對方法進(jìn)行確認(rèn)呢？在這種情況下，
對于方法確認(rèn)的時間甚至超過了樣品分析時間，這樣將是無效率（效益的）的，因為每個樣品的測試成本將會相當(dāng)?shù)母?。但答案很簡單：一個方法是否滿足于“有意
識目的”的首要前提就是能獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)；因此，只有經(jīng)過確認(rèn)的方法才能獲得有意義的數(shù)據(jù)。然而，基于實際情況，對于非例行測試方法的確認(rèn)可以減少一些項目
的確認(rèn)。歐洲化學(xué)分析協(xié)會（Eurachem）/CITAC在分析化學(xué)質(zhì)量指南文件：An
aid
例如，如果要分析在同基體中結(jié)構(gòu)類似新化合物，則驗證只需要幾個關(guān)鍵的試驗。對于這類通用方法的設(shè)計要考慮到每個步驟能夠容易適應(yīng)小變化，如樣品處理、樣品分析或數(shù)據(jù)評估。
為了確認(rèn)對于新分析物的分析是有效的，方法操作程序中應(yīng)該要求實施質(zhì)量審核。對所有試驗參數(shù)的詳細(xì)說明是為了確保后期在使用同種操作的時候工作能準(zhǔn)確的重復(fù)進(jìn)行。
依據(jù)ISO/IEC 17025，機(jī)構(gòu)所使用的所有技術(shù)的程序在使用前必須完全確認(rèn)或驗收。這種要求不僅適用于分析方法，同樣對于基于解釋說明性（interpretive decision）或主觀性方法，比如在刑事實驗、顯微鑒定、非破壞性測試方法、機(jī)械測試方法等文書鑒定、視頻分析、槍藥彈道檢驗等。這類方法提供測試對象間的一致性、可靠性水平，因此本文件中2,3節(jié)部分同樣適用于此類方法的確認(rèn)或驗收。
主觀性方法是分析人員利用經(jīng)驗和專業(yè)知識對樣品或測試樣品是否滿足某些要求作出說明，這類評價是定性數(shù)據(jù)和個人的專業(yè)性水平，要比分析測量來的更具挑戰(zhàn)性和less proscriptive.
準(zhǔn)確度和精密性兩個參數(shù)的評定較為適用于此類方法的確認(rèn)，而其他的確認(rèn)參數(shù)如線性或檢出限等則不適用于主觀性測試方法的確認(rèn)。
應(yīng)可考慮如下參數(shù)：
重復(fù)性/再現(xiàn)性；
可檢出概率(possibility of detection)和/或潛在錯誤概率(error rate)1
也可考慮的相關(guān)的消除或控制措施：
關(guān)鍵點（或風(fēng)險）分析（critical analysis）；
合作活動（測試），如實驗室內(nèi)和實驗室間比對測試2；
質(zhì)量控制；
相關(guān)人員的能力水平；
測試方法可接受水平
同樣，需要考慮如下幾個問題：
技術(shù)是否可以在其它的實際情況下應(yīng)用？方法的檢出限概率和錯誤率是否可被可靠的確定出？
注釋：1:機(jī)構(gòu)也許沒有辦法可靠地確定出說明性/對比性方法的檢出的概率或潛在錯誤概率，由于測試依賴于與分析人員的經(jīng)驗等。
2：實驗室內(nèi)比對可能提高不確定度。（？）
如果分析人員能夠?qū)σ阎栃曰蚨ㄐ缘慕Y(jié)果做出重復(fù)性正確判定，則方法為有效。這些重復(fù)性證據(jù)包括如下;
-不同分析人員利同一方法對同一特性參數(shù)所做出的評價的結(jié)果一致性水平（實驗室內(nèi)可靠）；或
-根據(jù)相同，方法同一分析人員在不同時間內(nèi)對同一特性參數(shù)所做出的評價的結(jié)果一致性水平（試驗間可靠）。
同樣也考慮包括對測試內(nèi)在一致性和利用其它方法評定等來評估方法可靠性。
當(dāng)要確認(rèn)或驗證主觀性方法的可靠性時，除了需要對POD或潛在錯誤率進(jìn)行評估，也還需要對靈敏性和選擇性作為關(guān)鍵性參數(shù)考慮。POD和潛在錯誤率都使用百 分比表示。POD表示能夠正確鑒定測定對象的可能性（likelihood）。POD經(jīng)驗性（empirical）評定方法對于新情況由于缺乏時間、測試 試樣和其它資源，而變得不實際。物理模型（physical models）可作為經(jīng)驗性方法的有用的替代方法，尤其是在數(shù)據(jù)有限，但其不能涵蓋所有的變異因素和來源。統(tǒng)計方法可以用于定量，調(diào)整系統(tǒng)偏差和變異來 源，這個在物理模型中是解決不了的。因此，結(jié)合經(jīng)驗和物理模型，統(tǒng)計學(xué)可能為實際工作的可用的方法。
潛在錯率經(jīng)常通過參加能力測試研究，以假設(shè)檢驗的“置信水平”和測試結(jié)果的統(tǒng)計顯著性水平來評價。它沒有唯一的定義。也可用假陽性率表示。
關(guān)鍵性參數(shù)C，可用此公式計算，C=POD*O*G，POD表示可可檢出概率，O為出現(xiàn)問題的可能性，導(dǎo)致不良結(jié)果的權(quán)重。合適的方法應(yīng)該是要將C降至一個可接受的水平。
通過參加合作測試如實驗室內(nèi)和實驗室間的比對實驗對于找出方法的局限性尤為重要，也可對于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生錯誤率的來源也是有效的。
任何主觀性測試必須要建立質(zhì)量控制程序。測試方法應(yīng)在任何可能的情況下，包括控制陰性和陽性的程序。如可通過與其他有能力的分析人員比對確認(rèn)測定結(jié)果。這 種比對應(yīng)確保后者對第一個的觀點是不知情的。這類核查的結(jié)果可組合來證明方法的可靠性。但不能忽視的是，可靠性會受到分析者的經(jīng)驗影響。
主觀性方法確認(rèn)的真正目的是為了驗證，當(dāng)在進(jìn)行一個有疑問（未經(jīng)確認(rèn)的）的測試時，能夠獲得準(zhǔn)確結(jié)果的可能性。主觀性測試基于定性評價的。分析員的專業(yè)是非常重要的。因此驗證必須需要分析者有廣泛的專業(yè)知識。進(jìn)行能力驗證是需要的。
一個好的和可接受的方法不是所有都需要相同的確認(rèn)或驗證的。需要考慮是否這些技術(shù)經(jīng)過peer審查或出版者認(rèn)可的期刊上。是否存在對技術(shù)操作的控制標(biāo)準(zhǔn)，這種技術(shù)是否能在相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)團(tuán)體所接受。
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