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基因定點突變：為了研究某一基因的功能，我們通常不僅需要研究其野生型基因的功能，也需要進一步去挖掘它發(fā)揮作用時是哪一個結(jié)構(gòu)域，甚至是哪一個氨基酸發(fā)揮了作用。而這里面就涉及到了如何設(shè)計定點突變引物的問題，今天為大家介紹一個在線網(wǎng)址--quickchange primer design，可以非常方便快捷為我們設(shè)計出合適的引物。你可以直接百度搜索quickchange或者輸入https://www./store/primerDesignProgram.jsp就可以進入到該網(wǎng)站的主頁面。 
該網(wǎng)站可以設(shè)計單點和多點突變引物以及刪除或者插入一段DNA序列（ 插入時只能插入小的DNA片段）。我們今天著重講解如何利用該網(wǎng)站設(shè)計引物，并利用該引物構(gòu)建出我們想要的突變體。
如果我們實驗室又窮，又不想買突變試劑盒怎么辦？我們可以不用管第2步，默認其設(shè)置，不用試劑盒也可以構(gòu)建出我們想要的突變體。第3個選項輸入我們的DNA序列，既可以通過Browse選項上傳已經(jīng)下載好的序列，也可以直接粘貼文本格式或FASTA格式的DNA序列。第4步將DNA序列轉(zhuǎn)換成蛋白序列（Upload Translated）。下面我們以人的TP53基因為例進行演示：首先我們從NCBI上下載TP53基因序列，將其粘貼到相應(yīng)選項框內(nèi)，并轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，如下圖：
同時我們也會看到多出來的選項5，如果我們要進行點突變，則需要勾選5后面的灰色圓圈
在下面這個框選中我們要突變的目的氨基酸，如紅色圓圈標(biāo)出所示：
同時在下面選框勾選出我們想要突變成的氨基酸，這個就表示我們將N29突變?yōu)?/span>I（N29I），S33突變?yōu)?/span>K (S33K)，L35突變?yōu)?/span>E (L35E)，E55突變?yōu)?/span>C (E55C)
該網(wǎng)站可以同時設(shè)計針對7個氨基酸的突變引物,接下來點擊Primer Design即可得到引物序列：
同時也能看到對應(yīng)引物的長度及其相應(yīng)的Tm值：
接下來我們再講如何刪掉一段DNA序列，同樣我們選擇or下面的小圓框，選中兩個氨基酸，即可設(shè)計出刪掉這兩個氨基酸之間片段的引物（注意：這兩個氨基酸不會被刪除）。
比如我們想刪掉第29個氨基酸和第51個氨基酸之間的片段，我們可選中29N和51E即可，如下圖
依舊點擊Primer Design即可設(shè)計出引物，且能看到引物與模板之間的配對情況。
好了，是不是感覺定點突變的引物設(shè)計很簡單呢？接下來，我們拿到引物就可以進行突變體構(gòu)建了。Nuclease-free water：up to 50 μL2. 然后就按照你所買的DNA高保真酶（PCR Enzyme）的說明書設(shè)置PCR反應(yīng)條件，我一般設(shè)置30個循環(huán)。3. PCR反應(yīng)結(jié)束后，直接加入Dpn I 限制性內(nèi)切酶（待突變的質(zhì)粒在細菌中會被甲基化修飾，因此，用Dpn I可以消化掉相應(yīng)的模板質(zhì)粒，而使突變質(zhì)粒保留下來）及相應(yīng)的buffer，37℃酶切反應(yīng)1h左右(也可相應(yīng)的縮短或延長酶切反應(yīng)時間)。4.直接用DNA回收試劑盒進行膠回收，根據(jù)濃度，取100ng進行轉(zhuǎn)化，涂平板。6.隨后將測序正確的樣品提質(zhì)粒，即可進行后續(xù)相關(guān)實驗。有沒有覺得點突變很簡單呢？如果你正在進行相關(guān)實驗，不妨試一試。注：個人經(jīng)驗，一般單點突變成功率較高，可達100%。在進行多點突變時可將多對引物放在一個PCR反應(yīng)體系中進行，但相應(yīng)的效率也會降低。筆者做過同時突變兩個點和四個點，將突變引物全部加到一個體系中，陽性率在25%~60%之間不等。
關(guān)注后獲取《科研修煉手冊》1、2、3、4、5、6、7、8、9
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