如何順利完成你的PCR實驗？

stingray928 2019-01-30

展開全文

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復制過程，是將在待擴增的DNA片段和與其兩側互補的兩個寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增 2n 倍。該技術已成為分子生物學中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR實用技巧—增加PCR特異性

圖片來源：pixabay

1.primers design

這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：

1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量；

2)GC%，40%~60%；

3)5'端和中間序列要多G/C，以增加穩(wěn)定性；

4)避免3'端GCrich，最后5個堿基不要多于2個G/C；

5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；

6)避免3'端的錯配；

7)避免內部形成二級結構；

8)附加序列(RTsite，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構時要加上它們；

9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；

10)最好學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Onlinedesign et al.

PCR擴增重要標準—靈敏度

圖片來源：pixabay

靈敏度指的是PCR擴增反應能夠檢測到目的基因最小值。研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，如，模板的復雜程度與完整性、引物純度及其與模板結合效率、反應溫度、DNA的熱穩(wěn)定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成（主要指：陽離子）、反應優(yōu)化劑等，均決定PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規(guī)PCR反應能夠檢測到pg(10^-12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系（包括：DNA聚合酶與反應緩沖液等）就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關鍵因素了。

與實驗室自配PCR擴增體系相比，東盛PCR Mix對反應緩沖液中的成分進行了優(yōu)化，并加入了適當比例的反應增強劑（PCREnhancer），提高了DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級結構對PCR擴增性能的影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高的檢測靈敏度。即使反應體系中只有幾個目的基因拷貝，也能輕松檢測。

PCR擴增重要標準—特異性