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PCR引物設(shè)計(jì)的原則

 whitecl 2011-05-19

PCR引物設(shè)計(jì)的原則(轉(zhuǎn)載)

默認(rèn)分類 2010-04-01 12:01:55 閱讀36 評(píng)論0   字號(hào): 訂閱

引物(primers)

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列,

一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ),

另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。

引物的重要性

在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合,不與其他非目的DNA結(jié)合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸,可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。

引物設(shè)計(jì)原則

引物長(zhǎng)度

一般為15-30個(gè)核苷酸,在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物,但最多不超過50個(gè)核苷酸。

堿基分布的均衡性

同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)

GC含量一般40-60%

GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低,使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性

GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。

引物Tm值

一般要求:55℃-65℃。

計(jì)算:

對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物,Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算

對(duì)于較長(zhǎng)引物,Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù),從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到,這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) – 273.15

引物二級(jí)結(jié)構(gòu)

引物二聚體

盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)

發(fā)夾結(jié)構(gòu)

尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。

引物3’端

引物的延伸從3’端開始,因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì),不能進(jìn)行任何修飾,否則不能進(jìn)行有效的延伸,甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。

引物5’端

引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基,在5’端引入一段非模板依賴性序列。

5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列(酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基)。

5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基,人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。

5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛等)。

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性

過去認(rèn)為,引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸,故3’端最好為G或C。

現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為,引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu),而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),即3’端盡可能選用A或T,少用G或C。

僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。

如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu),只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合,就可能引發(fā)延伸,造成假引發(fā)。

引物的保守性與特異性

保守性:通用引物——檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別

特異性:避免非特異性擴(kuò)增

擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)

模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),在選擇引物時(shí),應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。

擴(kuò)增區(qū)域的自由能(△G。)小于58.61kJ/mol

引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃

Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) – 500/length

引物與PCR

引物濃度:一般為0.1-0.5umol/L

引物濃度(uM)=n OD×33/(A×312+C×288+G×328+T×303-61)/VH2O VH2O (單位:L)

退火溫度

最適退火溫度(Ta Opt ) = 0.3 ×(Tm  of primer) + 0.7 × (Tm  of product) – 25

一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。

引物設(shè)計(jì)軟件

Primer Premier 5.0

生物軟件網(wǎng)下載

安裝后,用文本編輯器打開WIN.INI,將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。

Oligo

primer 3

The Primer Generator

NetPrimer

如何使用Primer Premier 5.0

引物設(shè)計(jì)

一般引物設(shè)計(jì)

5’帶酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

巢式PCR引物設(shè)計(jì)

多重PCR引物設(shè)計(jì)

探針設(shè)計(jì)

引物評(píng)析

引物同源性分析

用Blastn軟件進(jìn)行同源性比較

盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物

選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物

選擇兩個(gè)引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物

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