PCR引物設(shè)計(jì)的原則(轉(zhuǎn)載)默認(rèn)分類 2010-04-01 12:01:55 閱讀36 評(píng)論0 字號(hào):大中小 訂閱 引物(primers) 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列, 一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ), 另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。 引物的重要性 在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合,不與其他非目的DNA結(jié)合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸,可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。 引物設(shè)計(jì)原則 引物長(zhǎng)度 一般為15-30個(gè)核苷酸,在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物,但最多不超過50個(gè)核苷酸。 堿基分布的均衡性 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè) GC含量一般40-60% GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低,使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。 引物Tm值 一般要求:55℃-65℃。 計(jì)算: 對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物,Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 對(duì)于較長(zhǎng)引物,Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù),從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到,這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) – 273.15 引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物二聚體 盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ) 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸從3’端開始,因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì),不能進(jìn)行任何修飾,否則不能進(jìn)行有效的延伸,甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。 引物5’端 引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基,在5’端引入一段非模板依賴性序列。 5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列(酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基)。 5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基,人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。 5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛等)。 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過去認(rèn)為,引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸,故3’端最好為G或C。 現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為,引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu),而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),即3’端盡可能選用A或T,少用G或C。 僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。 如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu),只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合,就可能引發(fā)延伸,造成假引發(fā)。 引物的保守性與特異性 保守性:通用引物——檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別 特異性:避免非特異性擴(kuò)增 擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu) 模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),在選擇引物時(shí),應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。 擴(kuò)增區(qū)域的自由能(△G。)小于58.61kJ/mol 引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃ Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) – 500/length 引物與PCR 引物濃度:一般為0.1-0.5umol/L 引物濃度(uM)=n OD×33/(A×312+C×288+G×328+T×303-61)/VH2O VH2O (單位:L) 退火溫度 最適退火溫度(Ta Opt ) = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25 一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。 引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0 生物軟件網(wǎng)下載 安裝后,用文本編輯器打開WIN.INI,將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer 如何使用Primer Premier 5.0 引物設(shè)計(jì) 一般引物設(shè)計(jì) 5’帶酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì) 巢式PCR引物設(shè)計(jì) 多重PCR引物設(shè)計(jì) 探針設(shè)計(jì) 引物評(píng)析 引物同源性分析 用Blastn軟件進(jìn)行同源性比較 盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物 選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物 選擇兩個(gè)引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物 |
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