Potential Prognostic and Diagnostic Values of CDC6, CDC45, ORC6 and SNHG7 in Colorectal Cancer

CDC6、CDC45、ORC6和SNHG7在結(jié)直腸癌中的潛在預后和診斷價值

結(jié)直腸癌（CRC）是全球發(fā)病率最高的癌癥之一，也是癌癥死亡率的主要原因。結(jié)直腸癌的危險因素可分為兩個方面：不可改變危險因素和可改變的危險因素。不可改變的危險因素主要有年齡，性別，種族，家族病史，遺傳綜合征，可改變的風險因素有不健康的生活方式吸煙和飲酒。盡管近年來外科手術(shù)技術(shù)和輔助化學療法的進步改善了臨床結(jié)局，但晚期患者的預后仍然不佳。隨著技術(shù)的進步，全基因組分析已用于篩選和鑒定幾種癌癥中的關(guān)鍵基因。因此，需要找到CRC診斷和預后的標志物用于疾病管理。

作者研究了CRC與GEO的4個數(shù)據(jù)集的腫瘤和非腫瘤樣本之間的DEG。四個數(shù)據(jù)集中有519個共有DEG，包括306個上調(diào)基因和213個下調(diào)基因。在TCGA數(shù)據(jù)庫進行DELs差異分析，總共發(fā)現(xiàn)485個DEL，包括241個上調(diào)和244個下調(diào)的DELs。

圖1 癌和癌旁樣本之間DEGs和DELs的鑒定

作者用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO分析以確定519個DEGs的生物學功能。GO分析結(jié)果顯示，DEGs主要參與細胞分裂，蛋白質(zhì)結(jié)合和趨化因子活性等通路有關(guān)；KEGG富集分析表明，DEGs主要參與細胞周期，礦物質(zhì)吸收，DNA復制，氮代謝，造血細胞譜系和真核生物中的核糖體生物發(fā)生等信號通路。

圖2 DEGS的GO和KEGG通路富集分析

表1 腫瘤與非腫瘤樣本之間DEG的GO分析

表2 癌和癌旁樣品之間DEG的KEGG分析

作者選擇CDC6，CDC45，ORC6（均參與細胞周期通路）和lncRNA SNHG7基因在四個GEO數(shù)據(jù)集進行進一步研究，在TCGA高表達CDC6、CDC45和SNHG7具有更好的無復發(fā)生存率和總生存率。

圖3 TCGA中不同水平CDC6、CDC45和SNHG7表達的生存曲線

接著作者在四個GEO數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫進行驗證，與非癌組織相比，CRC組織中CDC6，CDC45和ORC6高表達，且CDC6和CDC45可能與TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而ORC6的表達與浸潤深度有關(guān)。與TCGA數(shù)據(jù)集中的非腫瘤組織相比，lncRNA SNHG7在CRC組織中也出現(xiàn)高表達。

圖4 四個數(shù)據(jù)集中CDC6、CDC45和ORC6的表達水平

圖5 TCGA中CDTC6，CDC45，ORC6和lncRNA SNHG7的表達

作者進一步分析發(fā)現(xiàn)CDC6和CDC45可能與臨床癥狀TMN有關(guān)；并且ORC6的表達與浸潤深度有關(guān)(p=0.003)。但SNHG7與 TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移之間暫無顯著性意義。

表3 GSE39582數(shù)據(jù)集中CDC6，CDC45，ORC6表達水平與CRC臨床癥狀的關(guān)系

表4 TCGA中CDC6，CDC45，ORC6表達水平與CRC臨床癥狀的關(guān)系

圖6 GSE39582中不同水平CDC6、CDC45和ORC6的表達的Kaplan-Meier生存曲線

通過Kaplan-Meier生存分析，作者根據(jù)基因表達量將患者分為高表達組和低表達組。在GSE39582的CRC樣本中，腫瘤樣本中CDC6，CDC45或ORC6低表達的患者的無復發(fā)生存期明顯較差。此外，低CDC6或低CDC45表達的患者OS較差且復發(fā)較早。在TCGA中，ORC6表達與CRC樣品的OS和RFS之間無顯著關(guān)系，而高SNHG7表達的CRC患者的OS顯著低于低SNHG7表達的CRC患者的總體生存期。

表5 GSE39582數(shù)據(jù)集中CRC的基因表達與臨床特征之間的相關(guān)性

此外，在GSE39582中CRC患者的Cox回歸分析顯示，CDC6，CDC45或ORC6表達低，TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤浸潤深度是影響預后的危險因素。多變量Cox回歸分析顯示，低CDC6，CDC45和ORC6的表達是CRC患者RFS的獨立危險因素。此外，對TCGA中CRC樣本的多變量Cox回歸分析表明SNHG7的表達，遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期是影響CRC患者OS的獨立危險因素。這些結(jié)果表明，CDC6，CDC45，ORC6以及SNHG6顯著影響CRC患者的預后。

表6 TCGA中CRC標本SNHG7的表達與臨床特征之間的相關(guān)性

圖7 在198個CRC和相鄰粘膜樣品中差異表達基因的驗證

為了驗證這幾個基因的表達差異，我們在198對配對的CRC和癌旁樣本中進行了RT-PCR驗證。結(jié)果顯示，4個基因均在癌組織中表達上調(diào)。隨后作者探討了CRC患者CDC6，CDC45，ORC6和SNHG7表達水平與臨床病理因素的相關(guān)性。

圖8 臨床病理特征與CDC6，CDC45，ORC6和SNHG7表達的關(guān)系

另外，在CRC組織中觀察到lncRNA SNHG7水平與CDC6 / CDC45 / ORC6表達水平呈正相關(guān)。這表明SNHG7可能通過調(diào)節(jié)CDC6、CDC45或ORC6的表達而影響CRC的細胞周期。

圖9  SNHG7與CDC6，CDC45和ORC6的表達相關(guān)性

作者進一步通過SNHG7，CDC6，CDC45和ORC6表達的ROC曲線評估了它們在CRC和良性組織之間的診斷價值。結(jié)果顯示，SNHG7的ROC曲線下面積（AUC）為0.84；CDC6為0.88；CDC45為0.82；ORC6為0.85。

圖10  SNHG7，CDC6，CDC45和ORC6區(qū)分CRC與良性疾病的診斷效能

在本研究中，作者首先從GEO四個數(shù)據(jù)集中檢測到519個常見差異表達基因，鑒定485個DELs作為診斷CRC的候選生物標志物，并進行了功能富集分析，進一步選定了四個分子作為研究對象，后續(xù)用PCR驗證了在臨床標本中的表達，并在最后用ROC曲線分析了CDC6、CDC45、ORC6和SNHG7的診斷作用，可作為CRC的潛在干預靶點，思路清晰。