【原】鏈讀測(cè)序技術(shù)在宏基因組組裝研究中的應(yīng)用

谷禾健康 2020-11-25

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鏈讀測(cè)序（Linked-read sequencing）通過將相同的barcode與長DNA片段(10-100kb)的序列連接在一起，能夠消除其中的一些錯(cuò)讀，從而改進(jìn)宏基因組組裝。但目前還不清楚在使用鏈讀測(cè)序時(shí)參數(shù)的選擇對(duì)組裝的質(zhì)量的影響如何。

近日，香港浸會(huì)大學(xué)研究人員發(fā)表文章 "通過鏈讀測(cè)序?qū)昊蚪M組裝全面研究"。

模擬數(shù)據(jù)和模擬菌群中的分析結(jié)果表明，模擬數(shù)據(jù)（simulated data）中讀取深度(C)與組裝序列的長度呈正相關(guān)，但對(duì)組裝序列的質(zhì)量影響不大，模擬菌群的研究中讀取深度(C) 對(duì)組裝序列的質(zhì)量以及被注釋為基因組草圖的bin的比例有輕微影響。

另一方面，宏基因組組裝質(zhì)量受 C_R（每個(gè)短讀長片段的平均深度）和 C_F（由長DNA片段計(jì)算的基因組的平均物理深度）的影響。對(duì)于相同的讀取深度，較深的 C_R會(huì)產(chǎn)生更多的基因組草圖，而較深的 C_F會(huì)提高基因組草圖的質(zhì)量。

還發(fā)現(xiàn)μ_FL (未加權(quán)的DNA片段的平均長度)對(duì)組裝有邊際效應(yīng)，而N_F/P（每個(gè)分區(qū)的片段數(shù)）對(duì)局部組裝涉及到的偏離目標(biāo)讀數(shù)(off-target reads)有影響，即較低的N_F/P值會(huì)通過減少off-target序列的錯(cuò)讀而有更好的組裝效果。

總體而言，與Illumina的短讀長相比，使用鏈讀改善了組裝中重疊群的N50，但與PacBio CCS的長讀長相比則沒有改善。

背景

人體微生物群是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，在生理活動(dòng)和疾病中起著重要的作用。對(duì)微生物群中的微生物基因組進(jìn)行測(cè)序可以幫助我們研究其功能。

然而，微生物基因組序列很難獲得，微生物群中的絕大多數(shù)微生物不能被分離出來進(jìn)行單個(gè)測(cè)序。目前的宏基因組項(xiàng)目中使用短讀長測(cè)序?qū)旌系奈⑸锘蚪M進(jìn)行測(cè)序。

這些結(jié)果在基因組組裝過程中是有錯(cuò)讀的，導(dǎo)致微生物基因組的完整性和重疊群的連續(xù)性結(jié)果不理想。長讀長測(cè)序已經(jīng)被用來嘗試減輕這些問題，如Nicholls等人和Sevim等人的研究。特別是Moss等人的研究，其成果優(yōu)化了納米孔測(cè)序的長讀長文庫制備方案，并獲得了更完整的細(xì)菌基因組。

但實(shí)際應(yīng)用中，長讀長測(cè)序是昂貴的。雖然鏈讀序列（linked-reads）的基因組組裝的質(zhì)量無法與PacBio CCS的長讀長相提并論，但其低成本和高堿基質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)是值得去使用的。

方法

三組鏈讀序列數(shù)據(jù)集的來源及構(gòu)成

模擬數(shù)據(jù)（simulated data）：

從MBARC-26數(shù)據(jù)集中下載了23個(gè)細(xì)菌和3個(gè)古細(xì)菌菌株，按豐度分類，L-sim，低豐度微生物，摩爾濃度<10^-15；M-sim，中等豐度微生物，10^-15< 摩爾濃度 < 10^-14；H-sim，高豐度微生物，摩爾濃度 > 10^-14

模擬菌群（mock community）：

(ATCC MSA-1003)是一個(gè)由20個(gè)菌株組成的池，同樣按豐度分類，L-mock，低豐度微生物；M-mock，中等豐度微生物；H-mock，高豐度微生物；UH-mock，超高豐度微生物。

人類腸道菌群：

一份來自健康的中國人糞便樣本

DNA提取、文庫制備和測(cè)序

對(duì)于模擬菌群，從ATCC 20菌株交錯(cuò)的混合基因組材料中提取DNA，不進(jìn)行大小選擇。

對(duì)于人類腸道菌群，用Qiagen QiAaMP糞便迷你試劑盒提取DNA，去掉5kb以下的DNA片段。

脈沖場凝膠電泳后，按照廠商的說明制備10x Chromium文庫。使用Illumina XTen雙端2x150bp測(cè)序。人類腸道微生物組的DNA也被用于標(biāo)準(zhǔn)的Illumina XTen短序列測(cè)序。

DNA長片段重建和鏈讀序列二次抽樣

Long Ranger v2.2.1用于糾正barcode堿基錯(cuò)誤，計(jì)算PCR重復(fù)率，并完成barcode感知的鏈讀序列比對(duì)。

使用BWA-MEM v0.7.17比對(duì)短序列和沒有barcode的鏈讀序列。根據(jù)映射得到的具有共同的barcode的短序列的坐標(biāo)重建DNA長片段。

鏈接序列首先按barcode排序，然后按它們的映射坐標(biāo)排序。如果最近的barcode序列大于50kb，則終止延伸長DNA片段。每個(gè)片段必須包括至少兩個(gè)具有共同barcode的成對(duì)序列，并且最小長度為2kb。

宏基因組組裝

對(duì)于鏈讀序列的組裝，沒有 barcode 的鏈讀序列首先由 metaSPAdes v3.11.1使用默認(rèn)參數(shù)組裝為“seed”重疊群，并通過BWA-MEM v0.7.17與重疊群比對(duì)。

最后使用 Athena-meta v1.3 通過匯集在 scaffold 中的兩個(gè)“seed”重疊群里共享相同 barcode 的序列進(jìn)行局部組裝。

組裝效果評(píng)估

MaxBin v2.2.4將長于1kb的重疊群分組到bins中，并通過CheckM v1.0.12評(píng)估其完整性和污染率。

Quast v5.0.0統(tǒng)計(jì)了基礎(chǔ)信息，如重疊群的N50、NG50、NGA50、總比對(duì)長度（total aligned length）和基因組覆蓋率（genomic coverage）。

Kraken v0.10.6基于內(nèi)置數(shù)據(jù)庫MiniKrakenDB為bins做物種注釋。每個(gè)bins都作為一個(gè)基因組草圖，被分類為高質(zhì)量的（完整性>90%，污染率<5%），中等質(zhì)量的（完整性≥50%，污染率<10%），低質(zhì)量的（完整性<50%，污染率<10%）

主要結(jié)果

來自人類腸道菌群和Illumina短序列鏈讀序列二次抽樣的組裝效果統(tǒng)計(jì)

ILLU，Illumina短序列的組裝

SC-all，模擬菌群和人類腸道菌群總共的兩個(gè)測(cè)序lane鏈讀序列

在鏈讀測(cè)序中，有四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)可能會(huì)影響宏基因組組裝，如下圖。

這些參數(shù)中有幾個(gè)是相互依賴的。例如，輸入DNA的量越大，C_F和N_F/P都會(huì)增加，C_R就會(huì)降低；C_F和C_R的絕對(duì)值是由總讀取深度(C)增加多少來設(shè)置的，因?yàn)?em style="box-sizing: border-box;">C_R×C_F=C。

L-sim，模擬數(shù)據(jù)中的低豐度微生物，青色

M-sim，模擬數(shù)據(jù)中的中等豐度微生物，藍(lán)色

H-sim，模擬數(shù)據(jù)中的高豐度微生物，紅色

L-mock，模擬菌群中的低豐度微生物

M-mock，模擬菌群中的中等豐度微生物

H-mock，模擬菌群中的高豐度微生物

UH-mock，模擬菌群中的超高豐度微生物

“-”表示測(cè)序lane的倒數(shù)，例如MSCR4/MSCF4表示四分之一測(cè)序lane的序列被二次采樣

MSCR-，模擬菌群中的短序列

MSCF-，模擬菌群中的長DNA片段

MSC-1，模擬菌群和人類腸道菌群總共的一個(gè)測(cè)序lane鏈讀序列

SC-all，模擬菌群和人類腸道菌群總共的兩個(gè)測(cè)序lane鏈讀序列

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參考文獻(xiàn)：

向上滑動(dòng)閱覽

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