2022年10月18日，南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊亮和環(huán)境學(xué)院夏雨科研團(tuán)隊聯(lián)合在Briefings in Bioinformatics雜志上在線發(fā)表了題為“A rapid bacterial pathogen and antimicrobial resistance diagnosis workflow using Oxford Nanopore adaptive sampling sequencing method”的研究論文。本文報道了一個對臨床樣本中的病原細(xì)菌及其攜帶耐藥基因進(jìn)行快速診斷的宏基因組學(xué)工作流程，該流程整合了基于GPU運(yùn)算的Nanopore適應(yīng)性采樣“人類DNA過濾”測序模式和自主研發(fā)的實時物種鑒定/抗性基因預(yù)測分析工具RUARGpore（https://github.com/sustc-xylab/RUARGpore.git），實現(xiàn)了上機(jī)4.5小時內(nèi)病原及所攜帶耐藥基因的精準(zhǔn)檢測。同時，該方法相比現(xiàn)有宏基因組學(xué)診斷方法有效的降低了成本，有利于大規(guī)模臨床推廣。

l  背景介紹及研究概述

高通量測序已成為檢測和鑒定環(huán)境樣本和臨床樣品中病原微生物的有效技術(shù)平臺，極大增強(qiáng)了診斷和跟蹤傳染病病原的能力，尤其是在診斷未知突發(fā)性病原體時相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)學(xué)方法及分子診斷具有顯著的優(yōu)勢。然而，臨床樣本的復(fù)雜性對宏基因組測序診斷提出了艱巨的挑戰(zhàn)。由于病原體負(fù)荷的變化、采集部位共生菌群的存在以及宿主細(xì)胞的高占比，宏基因組測序分析必須處理臨床樣本中的少量原核DNA和大量宿主DNA，這大大降低了微生物檢測的整體分辨率，極大浪費(fèi)測序成本，延長測序時間，影響后續(xù)病原體序列的檢出和耐藥基因的鑒定。納米孔適應(yīng)性采樣（nanopore adaptive sampling，NAS）測序直接在測序過程中通過快速的GPU運(yùn)算實現(xiàn)對目標(biāo)序列（例如人類DNA）的實時比對，以確定經(jīng)過納米孔的DNA分子是否應(yīng)該進(jìn)一步測序（接受）或直接從孔中移除（拒絕）。本研究開發(fā)了一個對病原細(xì)菌和抗生素耐藥基因（ARG）進(jìn)行快速精準(zhǔn)診斷的宏基因組學(xué)工作流程，該流程整合了基于NAS測序的“人類DNA過濾”模式和實時物種/抗性基因預(yù)測的分析工具RUARGpore，能實現(xiàn)臨床樣本DNA上機(jī)后自動化分析診斷。研究團(tuán)隊使用該流程對21個支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本進(jìn)行了分析，將微生物序列富集至少8倍，并在4.5小時內(nèi)從物種水平上準(zhǔn)確檢測到ARG。

l  研究內(nèi)容

1. 建立快速精準(zhǔn)診斷病原細(xì)菌及其攜帶耐藥基因的宏基因組學(xué)工作流程

本研究開發(fā)了一種新的mNGS工作流程，將NAS的實時測序數(shù)據(jù)流與分析工具RUARGpore相結(jié)合，快速精準(zhǔn)的檢測病原體和ARG，縮短檢測周轉(zhuǎn)時間。工作流程包括臨床樣本DNA提取、文庫制備、GridION NAS測序和RUARGpore軟件分析。該工作流程通過“人類DNA過濾”增加了臨床樣本中微生物序列的整體測序深度，而測序過程本身不改變微生物組成，從而在4.5?h內(nèi)完成復(fù)雜臨床樣本中低豐度病原體的鑒定和ARG檢測。

圖1 宏基因組管道的示意圖。mNGS工作流程包括臨床樣本DNA提取、文庫制備、GridION NAS測序和ARGpore2軟件分析。樣本采集后最多需要3小時即可完成DNA 提取和納米孔文庫制備，并且可以在啟動NAS測序運(yùn)行后1小時內(nèi)使用AMR基因分型進(jìn)行物種鑒定，平均周轉(zhuǎn)時間為4.5小時

2. 該檢測流程對低豐度微生物的富集效果

分析NAS測序結(jié)果，從模擬樣品中富集的微生物序列是正常測序方法中檢測到微生物序列的2.7倍。NAS測序結(jié)果同時提供了足夠的測序深度（即>>×基因組覆蓋率），可以較好的組裝模擬群落中的七種細(xì)菌。使用NAS測序從4922條與耐藥基因庫匹配的序列中識別出124個ARGs，其中119個ARGs是定位在7個細(xì)菌基因組上。以tet基因家族介導(dǎo)的四環(huán)素抗性為例，使用NAS測序再開始測序的5min內(nèi)就檢測到兩條比對到tet基因的序列。

圖2 用NAS測序富集模擬群落中的微生物物種。a) NAS 和對照運(yùn)行中七種微生物物種豐度的條形圖。 NAS 方法清楚地顯示了7種微生物與對照的比例非常相似，但都與模擬樣品中的真實比例有顯著差異。b）和 c）7種微生物 NAS（b）和正常測序（c）的物種基因組覆蓋率。d) 4?h測序后糞腸球菌基因組組裝。

圖3 使用NAS與正常測序檢測ARGs。a) NAS與正常測序的ARGs比對。 b) 弦圖說明ARG與7種攜帶ARG的致病物種之間的相關(guān)性。c) NAS與正常測序的tet基因比對數(shù)。正常測序的前5分鐘沒有檢測到tet基因，而在同一時間點在NAS測序中檢測到兩個tet基因。

3. 使用該檢測流程與常規(guī)Nanopore測序流程在同一張芯片上檢測BALF 1樣品的效果對比

將兩種海洋古菌（S. acidocaldarius：H. mediterranei=4:1）納入 B1 樣本作為內(nèi)部參考。S. acidocaldarius與H. mediterranei的比率在NAS測序中為3.6:1（讀數(shù) 498:137），在ONT正常測序中為2.6:1（讀數(shù) 132:51），而在 Illumina測序中未檢測到H. mediterranei。常規(guī)微生物學(xué)培養(yǎng)檢測到的病原微生物（肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌）用三種測序方法都檢測到。但不同的是，鮑曼不動桿菌在三種方法中檢測到的豐度最高10個物種占有一席之地，但肺炎克雷伯菌僅在NAS測序和ONT常規(guī)測序方法中排名前十。NAS 測序運(yùn)行的第1小時中檢測匹配為肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的序列，分別是ONT常規(guī)測序方法檢測到的190倍和16倍。使用NAS測序方法，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌攜帶屬于15種AMR類型的63個ARGs，鮑曼不動桿菌攜帶屬于7種AMR類型的31個ARG。使用正常的ONT測序方法，未檢測到病原體攜帶的ARGs。在NAS序列運(yùn)行的第 1h，檢測到42個ARGs（屬于11種不同的AMR類型）；6小時，檢測到鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌分別攜帶的7種AMR類型（28個ARG）和15種AMR類型（56個ARG）。

圖4 在B1樣本中使用NAS與正常測序進(jìn)行物種檢測。a) NAS、ONT 正常測序和 Illumina 測序檢測到的前十種物種的豐度（內(nèi)環(huán)為 NAS，中央為 ONT 正常測序，外環(huán)為 Illumina 測序）。b) NAS與正常測序的病原體（肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌）比對數(shù)。

圖5  NAS和正常測序檢測B1樣本中的ARGs。a) 弦圖說明ARGs與2種攜帶ARG的致病物種之間的相關(guān)性。b) NAS與正常測序的ARGs比對數(shù)。c) AMR類型檢測到的NAS數(shù)量與正常測序的比較。在NAS序列運(yùn)行的6小時中，檢測到鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌分別攜帶7種AMR類型（28個ARGs）和15種AMR 類型（56個ARGs）。

4. 應(yīng)用該流程使用單個ONT測序芯片同時對五個BALF樣品進(jìn)行檢測的效果展示

Shannon alpha 多樣性分析表明，Illumina 平臺測序的樣本始終比 NAS 測序的樣本具有更高的多樣性。使用 NAS 測序方法在常規(guī)微生物學(xué)陽性報告樣本中檢測到一致的病原微生物，在常規(guī)微生物學(xué)陰性報告樣本中未檢測到病原菌。該流程和實驗室培養(yǎng)之間的物種水平PPA為100%（16/16），NPA為100%。除了在三個樣本中檢測到較少的肺炎鏈球菌（B2，B6，B7均 < 1000 reads）外，使用 NAS 測序方法在其他受實樣本中檢測到高豐度的病原體。在B2、B6和B7中NAS序列運(yùn)行的前1小時，檢測到的用于產(chǎn)生可靠病原體鑒定的測序讀取數(shù)分別為16、24和13。相比之下，正常 ONT 測序的前 1 小時無法檢測到這些病原體。

使用本流程生成的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生可靠微生物物種和 AMR 鑒定所需的最短測序運(yùn)行時間。細(xì)菌物種的鑒定在所有時間點都是一致的，在NAS測序運(yùn)行的1小時內(nèi)宣布樣品為微生物陽性所需的最低檢測閾值。相比之下，檢測到的 ARG 和預(yù)測的AMR表型的數(shù)量在測序運(yùn)行過程中增加，大多數(shù) AMR 表型是在測序運(yùn)行的前6小時內(nèi)預(yù)測的?？傮w而言，結(jié)果表明微生物鑒定可以在測序運(yùn)行的第1小時內(nèi)確定，而大多數(shù) BALF ARGs可以使用6小時的測序運(yùn)行來表征。

圖6 在B2-B21樣本中使用NAS測序進(jìn)行物種檢測。a) 通過NAS和Illumina測序檢測到的物種數(shù)量。Shannon alpha多樣性分析表明，Illumina平臺測序的樣本始終比 NAS測序的樣本具有更高的多樣性。b) NAS產(chǎn)生序列比對到病原體的數(shù)目。

圖7 在72小時的測序程序運(yùn)行過程中檢測ARGs。a) 和 b) 確定檢測ARG和AMR表型所需的最佳測序時間。繪制每個樣品中檢測到的ARGs (a)和AMR表型(b)的總數(shù)，并使用Kruskal-Wallis H檢驗確定在不同時間點檢測到的ARGs和AMR表型的統(tǒng)計顯著性。實線，中位數(shù)；*，P值?<?0.05；**，P值?<?0.005。

l  總結(jié)展望

基于培養(yǎng)的微生物診斷和藥敏試驗已經(jīng)使用了70多年，作為急性感染的臨床管理指南存在一些局限性，主要是因為從樣本到結(jié)果的傳統(tǒng)檢測時間周轉(zhuǎn)緩慢?？焖佟?zhǔn)確的診斷將能夠及時使用適當(dāng)?shù)目股剡M(jìn)行治療，并改善治療結(jié)果和抗菌藥物管理。我們開發(fā)了一種新的 mNGS 工作流程，在 4.5?h 內(nèi)完成低豐度微生物標(biāo)本中的病原體的鑒定和ARGs檢測。這種時間差異在臨床上具有重要意義，尤其是在快速鑒定ARG和檢測厭氧菌和真菌方面?？焖俳Y(jié)果有可能限制不適當(dāng)?shù)慕?jīng)驗性抗菌藥物覆蓋率，降低相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。

本研究mNGS工作流程，可以在一張芯片上同時檢測5例樣本，成本約為每個樣本267美元。通過批量購買流動池（R9），使用快速條形碼測序工具（SQK-RBK004），可以同時對多個樣本進(jìn)行測序，從而進(jìn)一步降低成本。相比之下，對BALF樣本進(jìn)行Illumina元基因組測序分析的成本為445美元，兩者成本差異為178美元，這將大大減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本文介紹的mNGS檢測流程已經(jīng)申請中國發(fā)明專利保護(hù)。

l  作者信息

南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊亮、南方科技大學(xué)環(huán)境學(xué)院夏雨為本論文共同通訊作者。南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士生程航和南方科技大學(xué)環(huán)境學(xué)院孫瑜鴻為本文第一作者。華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院鄧名貴，余治健，南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院（深圳市第三人民醫(yī)院）朱剛，曲久鑫，劉磊等為該工作提供了重要臨床應(yīng)用指導(dǎo)。

l  通訊作者簡介：

共同通訊作者 楊亮 教授/博士生導(dǎo)師

作者單位：南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院

作者簡介：南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，2004年本科畢業(yè)于南開大學(xué)生物科學(xué)專業(yè)，2009年在丹麥技術(shù)大學(xué)獲得博士學(xué)位，隨后在丹麥技術(shù)大學(xué)和德國漢堡大學(xué)從事博士后工作，2012年入職新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院做助理教授，在2018年獲得終身教職 （副教授）和擔(dān)任生命科學(xué)學(xué)院助理院長，同時兼任新加坡國家級卓越研究中心"新加坡環(huán)境生物工程中心（SCELSE）"公共衛(wèi)生中心實驗室副主任。楊亮于2018年底全職加入南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院任教授，是廣東省杰出青年基金獲得者，深圳市海外引進(jìn)高層次人才，教育部青年特聘專家，新加坡南洋理工大學(xué)訪問教授。在國際學(xué)術(shù)期刊包括Lancet, Nature Communications，Nature Protocols, Proc Natl Acad Sci U S A, Science Signaling, Trends in Microbiology, Nano Letters，Current Opinion in Biotechnology，Briefings in Bioinformatics等發(fā)表論文180多篇，論文被引用超過11000次，H-Index 52（Google Scholar），入選2019、2020 愛思唯爾中國高被引學(xué)者和2019、2020全球前2%頂尖科學(xué)家榜單。

通訊作者 夏雨 助理教授（副研究員）/博士生導(dǎo)師

作者單位：南方科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院

作者簡介：夏雨博士，香港大學(xué)，水資源與環(huán)境工程博士?，F(xiàn)任南方科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院副研究員,博士生導(dǎo)師。環(huán)境微生物與生態(tài)基因組學(xué)實驗室負(fù)責(zé)人。研究興趣集中于：結(jié)合BONCAT, Single-cell sorting等先進(jìn)分子生物學(xué)手段、以Nanopore測序為代表的單分子高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析，解密生物處理反應(yīng)器、極端自然系統(tǒng)及潔凈室內(nèi)環(huán)境中微生物群系的群落構(gòu)建原理、功能調(diào)控機(jī)制以及關(guān)鍵基因（耐藥基因）轉(zhuǎn)移規(guī)律。近五年來在The ISME Journal, Environmental Science & Technology, Water Research 等頂級期刊發(fā)表論文40余篇，總引用次數(shù) 2600余次（Google Scholar），作為第一發(fā)明人申請發(fā)明專利3項?，F(xiàn)任中國工程院院刊Engineering (SCI impact factor 12.834) 、Frontiers in Energy Research (SCI impact factor 3.858)以及iMeta 編委。應(yīng)邀在國際會議做報告20余次，1次擔(dān)任分會主席，1次大會報告；曾擔(dān)任南方科技大學(xué)教授委員會環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院代表委員，美國微生物協(xié)會香港地區(qū)青年大使。