本文由謝忠杰編譯，董小橙、江舜堯編輯。

原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。

原名：Interplay between gut microbiota metabolism and inflammation in HIV infection

譯名：炎癥性腸病中腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝活動變化

期刊：The ISME Journal

IF：9.520

發(fā)表時(shí)間：2018年

通信作者：María José Gosalbes、Andrés Moya

通信作者單位：西班牙研究團(tuán)隊(duì)

HIV全稱為人類免疫缺陷病毒，為逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢性病毒亞科，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。HIV病毒顆粒呈球形，直徑100-120nm，與CD4+受體細(xì)胞有親和力。HIV病毒是二倍體病毒，其基因組由2個(gè)相同分子的正鏈單股RNA組成，病毒內(nèi)部有逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶、整合酶。

獲得性免疫缺陷綜合癥是由HIV引起的一種傳染性疾病，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（ART治療）的出現(xiàn)大大降低了HIV感染者的發(fā)病率和死亡率，但治療效果在感染人群中有差異：有些患者在ART治療后1-2年時(shí)間免疫系統(tǒng)功能得到一定程度恢復(fù)，稱為免疫應(yīng)答者（IR）；但有些患者在ART治療后1-2年時(shí)間免疫細(xì)胞的功能未得到有效恢復(fù)，稱為免疫無應(yīng)答者（INR）。

HIV感染是一個(gè)全球性的流行病。HIV侵入并破壞人體的正常免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道微環(huán)境平衡被破壞，改變腸道菌群組成以及代謝，破壞正常的宿主反應(yīng)機(jī)制。目前，關(guān)于研究腸道內(nèi)微生物菌群變化對HIV感染者健康的影響，已成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。以上為本文研究工作的背景。

2.1 研究隊(duì)列和臨床指標(biāo)

參考引文[5]，本文研究對象為：病毒血癥患者12例（VU=12），免疫應(yīng)答者18例（IR?=18），免疫無應(yīng)答者9例（INR=9），以及未感染HIV的健康對照15例（HIV-=15）。關(guān)于腸道炎癥、腸道細(xì)菌移位、胸腺功能、T細(xì)胞活化的生物標(biāo)記物也在引文[5]中有論述。

2.2 DNA/RNA提取和測序

參考引文[5]，本文的測序?qū)嶒?yàn)完成于西班牙瓦倫西亞公共衛(wèi)生研究中心，序列數(shù)據(jù)文件上傳至EBI數(shù)據(jù)庫，編號為PRJEB23871。

2.3 宏數(shù)據(jù)處理和生信分析

宏數(shù)據(jù)處理的思路如下：1）針對數(shù)據(jù)預(yù)處理，二代測序產(chǎn)生宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對DNAseq和RNAseq的原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量序列和宿主基因序列等預(yù)處理操作。2）針對序列拼接，宏基因組序列拼接使用Ray-Meta工具，宏轉(zhuǎn)錄組序列拼接使用Trinity工具，得到疊連群。3）針對基因預(yù)測，宏基因組ORF鑒定使用MetaGeneMark工具，宏轉(zhuǎn)錄組ORF鑒定使用TransDecoder工具，工具介紹請參考引文[33]。4）針對功能注釋，宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的功能注釋均使用rapsearch2工具比對KEGG數(shù)據(jù)庫，得到基因家族信息和基因通路信息。5）針對物種注釋，宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的物種注釋均使用blast工具比對Genomeclustdb數(shù)據(jù)庫。

生信分析的思路如下：1）使用LEfSe方法來識別物種標(biāo)記物和代謝通路標(biāo)記物。2）使用廣義線性模型GLM，將通路標(biāo)記物作為響應(yīng)變量，將物種分布作為預(yù)測變量，研究各物種與HIV相關(guān)代謝通路之間的相互作用。3）使用hmmsearch和blast工具比對ORFaanr數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)敏感性分析，研究HIV引發(fā)炎癥有關(guān)的代謝途徑。4）其他關(guān)于生態(tài)學(xué)、聚類、排序、相關(guān)性分析等方法的介紹，請參考本文的補(bǔ)充材料。

2.4 基因表達(dá)分析

基因豐度的計(jì)算方法：基于宏基因組序列數(shù)據(jù)，使用soap工具比對ORFaanr數(shù)據(jù)庫，計(jì)算各基因片段的豐度，流程請參考引文[37]。轉(zhuǎn)錄本豐度的計(jì)算方法：基于宏轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)，使用RSEM工具比對ORFaanr數(shù)據(jù)庫，再根據(jù)測序深度和轉(zhuǎn)錄本長度，計(jì)算各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量/豐度，數(shù)學(xué)單位FPKM?；虮磉_(dá)分析：通過計(jì)算各個(gè)功能基因的RNA/DNA豐度比值，來定義過表達(dá)基因或低表達(dá)基因，顯著性分析使用t-檢驗(yàn)和BH校正，方法請參考引文[15]。

2.5 生態(tài)網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)

生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法：基于DNAseq和RNAseq的物種注釋數(shù)據(jù)，生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中包含平均豐度大于0.01%且出現(xiàn)在70%以上樣本的物種。使用SparCC工具計(jì)算物種之間的相關(guān)性。使用igraph工具編輯共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法：基于DNAseq和RNAseq的功能注釋數(shù)據(jù)，代謝網(wǎng)絡(luò)中包含宏基因組顯示的通路和宏轉(zhuǎn)錄組顯示的通路。使用KEGG-graph和igraph工具編輯代謝網(wǎng)絡(luò)。關(guān)于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，介?shù)、度數(shù)、特征向量中心性，網(wǎng)絡(luò)碎片化等方法的介紹，請參考本文的補(bǔ)充材料。

2.6 多組學(xué)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)

基于宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)，使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)方法來預(yù)測T細(xì)胞活化、胸腺功能、細(xì)菌移位等對菌群的影響。關(guān)于馬爾可夫毯概念：針對貝葉斯網(wǎng)絡(luò)中任意一節(jié)點(diǎn)，其馬爾可夫毯包含了它的所有信息，而非馬爾可夫毯被認(rèn)為是它的冗余信息。

3.1 腸道菌群與HIV關(guān)聯(lián)的宏基因組

基于宏基因組數(shù)據(jù)，參考圖1a，NMDS聚類分析結(jié)果表明，HIV+組和HIV-組樣本中KO基因含量的差異性很大。其差異性同樣體現(xiàn)于各個(gè)患病HIV+組（VU組、IR組、INR組）和對照HIV-組的比較中。接下來使用LEfSe工具來分析微生物組間差異。參考圖1b，發(fā)現(xiàn)34個(gè)KEGG通路、186個(gè)KEGG直系同源基因可能是導(dǎo)致組間差異的基因和通路標(biāo)記物。例如，HIV+樣本菌群表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng)通路（ko00540、ko05111、ko05120）的增加，抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路（ko00250、ko00908）的增加，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路的減少。

圖  1

微生物組間差異不僅體現(xiàn)在功能方面，物種方面也有所體現(xiàn)。HIV+樣本菌群表現(xiàn)為Prevotella、Acidaminococcus、Streptococcus等菌屬的增加，而Bacteroides、Bifidobacterium、Akkermansia、Odoribacter、Alistipes等菌屬的減少。

3.2 腸道菌群與HIV關(guān)聯(lián)的宏轉(zhuǎn)錄組

基于宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，參考圖3a，NMDS聚類分析結(jié)果表明，HIV+組和HIV-組樣本中RNA-KO基因含量的差異性很大。接下來使用LEfSe工具來分析微生物組間差異。參考圖3b，部分結(jié)果如下，HIV+樣本菌群表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)通路（ko04141、ko00521、ko00730、ko00053）的轉(zhuǎn)錄本豐度增加，而抗炎癥代謝過程（ko00650、ko00640、ko00071）的豐度減少。

圖 3

本文計(jì)算log RNA/DNA豐度比值，來確定差異表達(dá)（過表達(dá)或低表達(dá)）的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV+組中49.08％的基因差異表達(dá)，其中13.89%過表達(dá)；而HIV-組中40.61％的基因差異表達(dá)，其中11.90%過表達(dá)。參考圖4，差異表達(dá)基因結(jié)果表明，HIV+樣本菌群表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)通路（ko00730、ko00521、ko4141）的過表達(dá)，而抗炎癥代謝通路（ko00640、ko00650）的低表達(dá)。因此宿主的局部炎癥反應(yīng)，可能致使微生物優(yōu)先表達(dá)那些減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)的代謝通路。

圖 4

基于宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的物種注釋結(jié)果，HIV+樣本菌群表現(xiàn)為Prevotella、Acidaminococcus、Coprobacillus、Streptococcus等菌屬的增加。這些被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄活躍細(xì)菌。

3.3 腸道菌群與HIV關(guān)聯(lián)的生態(tài)失調(diào)

使用廣義線性模型GLM分析，發(fā)現(xiàn)HIV+組中細(xì)菌物種標(biāo)記物與通路標(biāo)記物為正相關(guān)。該方法評價(jià)了物種標(biāo)志物是否攜帶與其正相關(guān)的通路標(biāo)記物的基因，或者促進(jìn)具有代謝功能的群落細(xì)菌的生長。本文發(fā)現(xiàn)物種標(biāo)志物提供了涉及其相關(guān)代謝通路的基因，而且普氏菌屬各個(gè)菌種都提供了涉及HIV相關(guān)通路的基因，表明普氏菌屬在HIV發(fā)病過程中的重要作用。

3.4 腸道菌群與HIV關(guān)聯(lián)的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)和功能網(wǎng)絡(luò)

共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)可以研究群落中生態(tài)和功能的相互作用。參考圖6a，腸道菌群與HIV關(guān)聯(lián)的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了連通性分布和小世界效應(yīng)等性質(zhì)。參考圖6b，該網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了20個(gè)模塊，各模塊都包含3個(gè)以上物種，最大模塊包含34個(gè)物種。大多數(shù)模塊的主導(dǎo)細(xì)菌為厚壁菌門與擬桿菌門，少數(shù)模塊的主導(dǎo)細(xì)菌為放線菌門和變形菌門。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，如果模塊中包含雙歧桿菌屬（放線菌門），則該模塊中不存在變形菌門，推測放線菌門和變形菌門有競爭關(guān)系。

圖 6

除了討論共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)，代謝網(wǎng)絡(luò)也展示了3700種酶和31725條互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了KO標(biāo)記物是代謝網(wǎng)絡(luò)的核心，揭示了其與HIV微生物代謝過程的相關(guān)性。

3.5 腸道菌群失調(diào)和宿主健康

基于宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、代謝組、臨床指標(biāo)等數(shù)據(jù)，使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)來研究腸道菌群失調(diào)對HIV免疫發(fā)病機(jī)理的綜合影響。本文貝葉斯網(wǎng)絡(luò)（臨床指標(biāo)、功能基因）包含190個(gè)節(jié)點(diǎn)和548條連線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，代謝相關(guān)通路的馬爾可夫毯與臨床指標(biāo)有很多聯(lián)系。參考圖7，針對丁酸代謝的馬爾可夫毯（丁酸MB），總共包括89個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中16個(gè)是臨床變量節(jié)點(diǎn)，而且與丁酸代謝有直接聯(lián)系的是炎癥（hs-CRP）、細(xì)菌移位（BPI）、內(nèi)皮功能障礙（ADMA）、凝血（D-dimers）等標(biāo)記物。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)丁酸代謝與丙酸代謝通路（ko00640）呈現(xiàn)正相關(guān)，與脂肪酸代謝通路（ko00071）呈現(xiàn)正相關(guān)，與Nadir CD4⁺T細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)CD4⁺T細(xì)胞數(shù)目與鼠膽酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)，已知鼠膽酸在HIV患病人群中過量表達(dá)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，免疫激活標(biāo)記物例如HLA-DR⁺CD38⁺CD4⁺T細(xì)胞、HLA-DR⁺CD38⁺CD8⁺T細(xì)胞，與齊墩果烷型三萜代謝物、各種膜結(jié)構(gòu)脂質(zhì)均呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。

圖 7

本文通過解讀微生物組學(xué)的研究成果，幫助改善臨床治療效果，并且指導(dǎo)新療法的開發(fā)。請參考本文Disscussion部分內(nèi)容。

本文作者首先回答了HIV感染后的人體腸道菌群中細(xì)菌的種類和細(xì)菌參與的代謝過程，其次回答了與HIV疾病關(guān)聯(lián)的細(xì)菌種類、基因表達(dá)和基因功能，然后使用網(wǎng)絡(luò)方法研究了腸道微生物群落的內(nèi)外關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析具體如下：基于宏組學(xué)數(shù)據(jù)的物種注釋信息，可以做生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析；基于宏組學(xué)數(shù)據(jù)的功能注釋信息，可以做代謝網(wǎng)絡(luò)分析；基于宏組學(xué)數(shù)據(jù)、代謝組數(shù)據(jù)以及臨床指標(biāo)，可以做貝葉斯網(wǎng)絡(luò)分析。

小編認(rèn)為感興趣的讀者可以：1）琢磨社交網(wǎng)絡(luò)/生態(tài)網(wǎng)絡(luò)/生物網(wǎng)絡(luò)的一般性質(zhì)；2）使用R/Python/CytoScape軟件實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的可視化；3）討論酶的網(wǎng)絡(luò)圖（功能基因的網(wǎng)絡(luò)圖）是否有研究價(jià)值。同時(shí)歡迎讀者朋友與小編反饋意見并討論想法。

主要參考文獻(xiàn)

[ref5] S. Serrano-Villar, et al. The effects of prebiotics on microbial dysbiosis, butyrate production and immunity in HIV-infected subjects. Mucosal Immunol. 2017.

引用內(nèi)容；樣本數(shù)據(jù)來源（引文作者系西班牙研究團(tuán)隊(duì)）。

[ref15] E.A. Franzosa, et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. PNAS. 2014.

引用內(nèi)容；轉(zhuǎn)錄本豐度的計(jì)算方法。

[ref37] H.B. Nielsen et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes. Nature Biotechnology. 2014.

引用內(nèi)容：基因豐度的計(jì)算方法。

[ref33] B. Hass, et al. TransDecoder (find coding regions within transcripts). 2015.

引用內(nèi)容：TransDecoder工具（識別轉(zhuǎn)錄本序列中的編碼區(qū)域）。

你可能還喜歡

1. 年度總結(jié) | 100篇微生物相關(guān)高分綜述免費(fèi)領(lǐng)取（附贈10篇國自然標(biāo)書）
   

2. 腸道菌群及代謝相關(guān)試驗(yàn)如何設(shè)計(jì)？20篇高影響因子文章供您參考！（免費(fèi)領(lǐng)取文獻(xiàn)包）