CRISPR/Cas9是由RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，其靶向與sgRNA互補(bǔ)的特定基因組序列，通過(guò)Cas9酶的RuvC和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)е?strong>DNA雙鏈斷裂（DSB）。DSB導(dǎo)致非保守的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑，在靶位點(diǎn)上的堿基插入或缺失經(jīng)常導(dǎo)致基因的移碼突變或完全敲除。

CRISPR/Cas9特別令人感興趣的是可以用于敲除人類遺傳病相關(guān)基因，用于構(gòu)建體外和體內(nèi)疾病模型，并且有希望用于基因治療。四川大學(xué)華西醫(yī)院是第一個(gè)提交CRISPR/Cas9臨床試驗(yàn)的，該試驗(yàn)通過(guò)注射Cas9基因編輯后的T細(xì)胞，以評(píng)估PD-1基因敲除工程化T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的安全性。

然而，CRISPR/Cas9技術(shù)始終面臨脫靶效應(yīng)的擔(dān)憂。關(guān)于基因組不穩(wěn)定性和染色體完整性的安全問(wèn)題尚未得到深入研究，CRISPR/Cas9基因編輯導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定性很可能被低估了。

2018年8月8日，Paul Q. Thomas 等人在 Nature 發(fā)表的一篇題為：Large deletions induced by Cas9 cleavage 論文顯示，CRISPR/Cas9切割后小鼠受精卵中出現(xiàn)頻繁的大量堿基缺失（千堿基量級(jí)）[1]。

2017年11月24日，中科院神經(jīng)所楊輝等人在 Genome Biology 發(fā)表題為：CRISPR/Cas9-mediated targetedchromosome elimination 的研究論文，表明在人的同一染色體上的多個(gè)Cas9介導(dǎo)的DNA切割可以消除整個(gè)染色體，從而為染色體數(shù)目異常疾病建模提供了一種新方法[2]。

然而，雖然核酸酶是基因組編輯的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是在人類細(xì)胞中造成一個(gè)DNA雙鏈斷裂（DSB）之后是否會(huì)導(dǎo)致染色體的部分缺失或整個(gè)缺失仍然是未知的。

2019年3月8日，法國(guó)波爾多大學(xué)的研究人員在 Nature 子刊 Nature Communications 雜志發(fā)表題為：CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations  的研究論文。

該研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因組編輯會(huì)誘導(dǎo)出現(xiàn)百萬(wàn)堿基規(guī)模的染色體大片段缺失。這么大長(zhǎng)度的片段缺失，比脫靶效應(yīng)更為嚴(yán)重。揭示了Cas9誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）對(duì)人類細(xì)胞基因組的全局性破壞作用。

該研究使用兩種不同的癌細(xì)胞系和 P53 基因失活的永生化成纖維細(xì)胞，在Cas9酶介導(dǎo)的僅有一個(gè)雙鏈斷裂（DSB）的情況下，在10%癌細(xì)胞系和7.7%成纖維細(xì)胞中觀察到高頻率的染色體末端缺失。而且這種缺失不是由于Cas9酶的多次切割造成的。

這種兆堿基級(jí)末端缺失（7.5 Mb）遠(yuǎn)大于 Paul Q. Thomas 等人2018年8月在小鼠受精卵中描述的千堿基級(jí)缺失。雙鏈斷裂引起的這種大規(guī)模的堿基缺失很可能導(dǎo)致臨床應(yīng)用的嚴(yán)重后果。

該研究中，雙鏈斷裂造成的染色體截短，直接造成了43個(gè)基因的丟失，這43個(gè)基因中，5個(gè)是原癌基因，7個(gè)是抑癌基因，令人震驚的是，這7個(gè)抑癌基因中有5個(gè)是抑制白血病的抑癌基因。這些抑癌基因的丟失，很可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變。

該實(shí)驗(yàn)還觀察到有的細(xì)胞的雙鏈斷裂接口上游發(fā)生DNA序列的復(fù)制重復(fù)，這也證明了DNA雙鏈斷裂后的修復(fù)機(jī)制的復(fù)雜性。

2018年6月，兩篇 Nature Medicine 論文表明CRISPR/Cas9基因編輯后的細(xì)胞往往是p53基因發(fā)生突變的細(xì)胞，有變成癌細(xì)胞的可能性。詳情：CRISPR基因編輯后的細(xì)胞很可能存在癌變風(fēng)險(xiǎn)

因此，在進(jìn)行任何CRISPR基因編輯臨床應(yīng)用之前，必須評(píng)估CRISPR基因編輯誘導(dǎo)雙鏈斷裂后的這種致癌風(fēng)險(xiǎn)，以避免產(chǎn)生易癌變的細(xì)胞，尤其是使用逆轉(zhuǎn)錄病毒這種整合型病毒作為CRISPR基因編輯遞送載體的方案。

實(shí)現(xiàn)對(duì)基因突變位點(diǎn)的精確校正，沒有插入突變和其他脫靶現(xiàn)象，是基因治療的終極目標(biāo)。但是最近的一系列研究說(shuō)明，CRISPR基因編輯距離這一終極目標(biāo)還有很遠(yuǎn)距離，也還需要更多的研究和改進(jìn)。

參考文獻(xiàn)：

1、https://www./articles/s41586-018-0380-z

2、https://genomebiology./articles/10.1186/s13059-017-1354-4

3、https://www./articles/s41467-019-09006-2

4、https://www./articles/s41591-018-0050-6

5、https://www./articles/s41591-018-0049-z