Cas9可以誘導(dǎo)廣泛的在sgRNA結(jié)合位置的損傷，包括大的缺失，倒位和插入。

一石激起千層浪，在靶點位置出現(xiàn)大的片段的活性的問題，正日益成為人們最終使用Cas9用于臨床實驗的障礙。

Cas9由gRNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶活性，在細菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中被發(fā)心啊，相應(yīng)的工具開發(fā)在人類治療中具有很大的前景，使用CRISPR-Cas9的臨床試驗?zāi)壳罢诿绹椭袊M行。對于基于CRISPR的治療劑的臨床使用的長期公認的潛在限制是與脫靶效應(yīng)相關(guān)的安全性問題，所述脫靶效應(yīng)導(dǎo)致切割與靶位點高度同源的并不希望被編輯的DNA位點。Kosicki等人表明除了脫靶效應(yīng)外，CRISPR-Cas9的靶向作用也是不可預(yù)測的，復(fù)雜的，并且可能存在問題。這表明在人類治療應(yīng)用中采用CRISPR時可能需要更加謹慎。

Cas9核酸酶以指導(dǎo)RNA（gRNA）依賴的方式切割染色體DNA，在細胞中產(chǎn)生位點特異性DNA雙鏈斷裂（DSB），其通過同源重組或非同源末端連接（NHEJ）的修復(fù)產(chǎn)生希望的遺傳修飾。為了破壞X連鎖的PigA基因，Kosicki等人首先將針對該基因的內(nèi)含子或外顯子位點的Cas9和gRNA引入雄性小鼠胚胎干（ES）細胞。出乎意料的是，單個gRNA靶向位于距離最近的外顯子數(shù)百到數(shù)千堿基對的內(nèi)含子位點，可能作為陰性對照，產(chǎn)生頻率為5-20％的PigA缺陷細胞，表明DSB修復(fù)可能涉及大的缺失延伸長達數(shù)千堿基對。此外，他們選擇常染色體Cd9基因座以顯示靶向遠端內(nèi)含子位點的gRNA也產(chǎn)生Cd9缺陷細胞。顯然，這些事件不限于某些基因座或等位基因數(shù)或細胞類型或Cas9表達或遞送方法。作者觀察到兩個小鼠胚胎干細胞系，小鼠造血干細胞和人類女性色素性視網(wǎng)膜上皮細胞中單等位基因和雙等位基因位點的單個gRNA介導(dǎo)的大型缺失，無論Cas9的表達或遞送是否是穩(wěn)定整合或者瞬時轉(zhuǎn)染的。

由單個Cas9誘導(dǎo)的切割引起的高頻率的大缺失是出乎意料的，因為人們普遍認為Cas9觸發(fā)的誘變NHEJ導(dǎo)致DSB位點處<20個堿基對的小插入或缺失（插入缺失）。大多數(shù)研究人員之前忽略大的缺失，因為這些事件不能通過常規(guī)的短程PCR和基因分型方法檢測到，以檢測靶位點附近的局灶性突變。值得注意的是，Kosicki等人沒有進行基因分型以獲得基因敲除細胞。他們首先在選擇條件下分離敲除細胞，然后進行基因分型，這是一種不怎么常用的基因技巧。

為了詳細了解和表征這些分子事件，作者使用長程PCR和PacBio或Sanger測序仔細分析了一組PigA或Cd9缺陷細胞和單細胞衍生的PigA或Cd9缺陷克隆。正如所料，大多數(shù)編輯的等位基因包含跨越靶位點和最近的外顯子的高達9.5千堿基的染色體DNA的大量缺失。大部分（17％）的編輯事件涉及復(fù)雜的，通常是非連續(xù)的突變，例如從其他染色體插入DNA片段，倒位，重復(fù)和除了大的缺失之外的單核苷酸變異。很難將所有這些不尋常的突變等位基因作為PCR或測序工件的問題。由兩個核酸酶誘導(dǎo)的兩個同時發(fā)生的DSB的修復(fù)經(jīng)常引起易位，反轉(zhuǎn)，重復(fù)和大的缺失，但是單個DSB如何引起這種復(fù)雜的重排是一個謎。

Kosicki等人警告說，廣泛的靶向損傷，特別是涉及易位的損傷，可能激活人類基因組中數(shù)百種休眠癌基因中的一種，導(dǎo)致患者癌癥，使人聯(lián)想到基因治療后逆轉(zhuǎn)錄病毒插入后LMO2致癌基因激活。治療X連鎖嚴重聯(lián)合免疫缺陷?？紤]到靶基因位點上基因組重排的復(fù)雜性和不可預(yù)測性，人們不能排除轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9的數(shù)十億細胞中具有偶然原癌基因激活的單個細胞可能增殖的可能性。在離體治療中，使用長程PCR和使用RNA-seq潛在的癌基因轉(zhuǎn)錄監(jiān)測靶向突變是有必要的，如果不是足夠的話。如果可能的話，應(yīng)該選擇單細胞衍生的克隆，在全基因組測序后沒有觀察到異常的靶上損傷或脫靶突變。例如，可以在體外擴增之前對基因編輯的誘導(dǎo)多能干細胞的克隆群體進行測序。通過在植入種系基因編輯之前對卵裂球進行測序，還可以校正人胚胎并檢查基因組完整性。

最近，Kim的小組和其他人使用特異于CRISPR-Cas9的MYBPC3突變等位基因來糾正導(dǎo)致Cas9靶位點雜合的人胚胎中的肥大性心肌病的突變。使用野生型母體等位基因而不是合成寡核苷酸模板修復(fù)突變體父本等位基因中絕大多數(shù)Cas9誘導(dǎo)的DSB，表明同源重組（IHR）是人胚胎中的顯性DSB修復(fù)途徑。 Egli等[質(zhì)疑了這一結(jié)論，他提出了其他假設(shè)，如大型缺失或染色體丟失，并要求進行其他分析，包括長程PCR。

為了回應(yīng)這種合理的批評，Kim和Mitalipov小組（未發(fā)表的數(shù)據(jù)）最近使用長程PCR和單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因分型分析了從基因校正胚胎中分離的基因組DNA，以排除大量缺失的可能性。提供IHR的直接證據(jù)。值得注意的是，在Kosicki等人的研究中，一些Cd9編輯的等位基因具有局部雜合性缺失或兩個同源染色體的交叉，似乎顯示出IHR的證據(jù)。這表明，盡管兩項研究中的實驗設(shè)置不同，但可能涉及類似的機制。修復(fù)DSB。

Kosicki等生成的數(shù)據(jù)無疑提高了在體細胞和種系基因治療中安全使用CRISPR-Cas9基因編輯工具的標準。除了脫靶效應(yīng)之外，必須仔細監(jiān)測并在未來的臨床試驗中控制可能的目標效應(yīng)。在這方面，令人鼓舞的是，自2013年以來，研究人員已經(jīng)做出了相當(dāng)大的努力來定義和控制全基因組CRISPR脫靶效應(yīng)，為更安全的治療基因編輯奠定了基礎(chǔ)。 CRISPR靶向位點上的大缺失，復(fù)雜重排和IHR的確切機制仍然未知，需要進一步研究。與往常一樣，我們學(xué)的越多，我們的問題就越多。