基于CRISPR的基因組編輯在生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用方面都顯示出了巨大潛力。與小分子藥物和抗體藥物相比，CRISPR能夠直接靶向特定核酸序列，很大程度上解決了不可成藥靶點(diǎn)限制，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

CRISPR-Cas基因編輯依賴于向?qū)NA（gRNA）的識(shí)別和靶向，gRNA的非特異性靶向可能會(huì)引入意料之外的脫靶編輯，從而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳毒性。這也是CRISPR基因編輯療法臨床應(yīng)用中面臨的一大限制因素。因此，人們迫切需要了解脫靶編輯的結(jié)果，以及由此產(chǎn)生的DNA易位（DNA translocation）等問(wèn)題。

DNA易位一直是CRISPR基因編輯的一個(gè)重要問(wèn)題，盡管它發(fā)生的頻率相對(duì)較低，但通常會(huì)導(dǎo)致高遺傳毒性。DNA易位的潛在風(fēng)險(xiǎn)通常發(fā)生在例如使用CRISPR基因編輯的CAR-T細(xì)胞中，多個(gè)gRNA被引入到T細(xì)胞中進(jìn)行多位點(diǎn)基因編輯，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂（DSB）末端的易位風(fēng)險(xiǎn)。隨著基于CRISPR基因編輯的同種異體CAR-T細(xì)胞療法開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗(yàn)，迫切需要開(kāi)發(fā)出能夠系統(tǒng)性鑒定DNA易位的方法。

2022年12月12日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬麗佳團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：PEAC-seq adopts Prime Editor to detect CRISPR off-target and DNA translocation 的研究論文。

該研究利用先導(dǎo)編輯（Prime Editor，PE）的序列插入能力，用Cas9代替PE中的Cas9n，與逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV融合，開(kāi)發(fā)了一種新型脫靶鑒定方法——PEAC-seq（Prime Editor Assisted off-target Characterization）。

PEAC-seq提供了一個(gè)全面和簡(jiǎn)化的策略來(lái)鑒定細(xì)胞和體內(nèi)的CRISPR脫靶編輯，以及Cas9導(dǎo)致的DNA易位。這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步豐富了用于評(píng)估CRISPR在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中的遺傳毒性的工具包。

由于CRISPR基因編輯技術(shù)對(duì)遺傳疾病、癌癥等疾病治療有著很大潛力，因此對(duì)體內(nèi)CRISPR基因編輯的脫靶鑒定和相應(yīng)的毒性評(píng)估具有很高的要求。

2019年，劉如謙（David Liu）團(tuán)隊(duì)在 Nature 發(fā)表論文【2】，開(kāi)發(fā)了一種新型基因編輯工具——Prime Editor，Prime Editor在Cas9酶和gRNA兩方面進(jìn)行了重大改造，在gRNA的3'末端增加了一段RNA序列，形成所謂的pegRNA；將Cas9切口酶（Cas9n，只切斷含PAM序列DNA單鏈）與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，形成融合蛋白。

pegRNA的3'端序列有雙重角色，一段序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS），與斷裂的靶DNA鏈3'末端互補(bǔ)以起始逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，另一端序列則是逆轉(zhuǎn)錄模板（RT模板），其上攜帶有目標(biāo)點(diǎn)突變或插入缺失突變以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因編輯。

Prime Editor的基因編輯原理

為了兼容對(duì)體內(nèi)CRISPR基因編輯的脫靶檢測(cè)，檢測(cè)方法應(yīng)該簡(jiǎn)化編輯和脫靶富集過(guò)程，而不依賴于外源片段。為此，研究團(tuán)隊(duì)使用Cas9代替Cas9n，與逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV的融合蛋白（Cas9-MMLV），以利用Prime Editor的序列插入能力。

Cas9-pegRNA在基因組的上靶和脫靶位點(diǎn)都能夠產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），標(biāo)記序列將通過(guò)pegRNA的逆轉(zhuǎn)錄引入DSB位點(diǎn)，并通過(guò)DNA修復(fù)來(lái)插入基因組中。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)21nt的插入標(biāo)簽，利用pegRNA模板插入標(biāo)簽序列進(jìn)行富集。

PRAC-seq技術(shù)

在PEAC-seq中，優(yōu)化后的逆轉(zhuǎn)錄模板（RT模板）可以整合到靶位點(diǎn)或者脫靶位點(diǎn)中，進(jìn)一步對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行富集。PEAC-seq伴隨著CRISPR編輯和插入標(biāo)簽的過(guò)程，確保了編輯與PEAC-seq信號(hào)的一致性。

將PEAC-seq在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的若干位點(diǎn)分別進(jìn)行測(cè)試，并與GUIDE-seq、DISCOVER-seq、WGS和Amplicon-seq等檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，證明了PEAC-seq可以有效地識(shí)別脫靶位點(diǎn)。

此外，得益于定向插入的PEAC-seq標(biāo)簽，PEAC-seq能夠系統(tǒng)識(shí)別DNA易位，之前的方法只能知道一些固定位點(diǎn)的染色體易位，而無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，而DNA易位通常意味著更大的細(xì)胞毒性。

PEAC-seq從編輯過(guò)的小鼠胚胎中鑒定出PCSK9脫靶

總的來(lái)說(shuō)，PEAC-seq是一種識(shí)別CRISPR脫靶和脫靶相關(guān)DNA易位的無(wú)偏倚方法。由于無(wú)需添加高摩爾濃度的外源性短雙鏈寡核苷酸（dsODN），因此在體內(nèi)CRISPR編輯中，PEAC-seq在識(shí)別脫靶和DNA易位方面具有巨大潛力，這對(duì)CRISPR基因編輯的轉(zhuǎn)化應(yīng)用尤其有價(jià)值。