CRISPR–Cas9技術(shù)將來在臨床上的應(yīng)用面臨最大的顧慮是Cas9的脫靶率。

5月30日，Nature Methods發(fā)表的一篇文章聲稱“CRISPR-Cas9技術(shù)可引發(fā)基因組上發(fā)生數(shù)百個意想不到的的基因突變”（CRISPR可致數(shù)百個位點突變，引入基因治療需謹(jǐn)慎），引起軒然大波，不過該論文在今年3月份被撤稿（爭議熱門論文遭撤稿丨特別關(guān)注）。

然后今年5月份，Genentech公司的研究團隊在Nature Methods雜志上發(fā)表文章，詳細(xì)分析了編輯的小鼠和大鼠身上的脫靶位點（重審CRISPR的脫靶效應(yīng)，Nature Methods發(fā)文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點）。

事實上，CRISPR–Cas9技術(shù)除了面臨脫靶問題，另一個面臨的深層次問題是還可能在作用靶點附近導(dǎo)致大規(guī)模的DNA刪除，在部分情況下，甚至引起復(fù)雜的DNA重排，研究人員發(fā)現(xiàn)在小鼠干細(xì)胞和人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)，可能出現(xiàn)規(guī)模達(dá)數(shù)千DNA堿基的刪除，導(dǎo)致臨近基因或調(diào)控序列可能受到影響，并改變細(xì)胞功能，因此引起的DNA重排問題也成為了CRISPR–Cas9技術(shù)面臨的另一個安全隱患，相關(guān)工作剛剛在線發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上。為了使讀者更好的了解該工作，BioArt特別邀請了對相關(guān)領(lǐng)域有過深入研究的北京大學(xué)胡家志研究員對該工作進行點評分析，以饗讀者！

論文原文：Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

點評丨胡家志（北京大學(xué)）

CRISPR/Cas9在基因治療方面展現(xiàn)出巨大的潛力，其主要通過在預(yù)定位點上產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂來啟動基因的改造或替換。作為高表達(dá)量的外源性酶，Cas9在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)并無共演化形成的嚴(yán)密調(diào)控系統(tǒng)，幾乎注定它會成為一匹脫韁野馬，在基因組上造成預(yù)計外的損傷。不久前Warming團隊及合作者在Nature Methods上撰文，在單細(xì)胞水平上對Cas9的脫靶活性進行了描述【1】（重審CRISPR的脫靶效應(yīng)，Nature Methods發(fā)文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點）。

Bradley及其同事剛剛在線發(fā)表的這篇Nature Biotechnology文章進一步探討了CRISPR/Cas9在目的編輯位點附近所造成的大片段缺失及其它復(fù)雜的重組【2】。他們所呈現(xiàn)的最新結(jié)果并不讓人意外，這些數(shù)據(jù)表明CRISPR/Cas9造成的DNA雙鏈斷裂與其它機制產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂并無明顯不同，盡管有報道表明Cas9在切開DNA后會在斷裂末端上停留【3】，可能會影響下一步的修復(fù)過程。

DNA雙鏈斷裂的修復(fù)需經(jīng)歷四個步驟──識別、加工（如必要）、連接及末端拴綁。DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，以ATM激酶為首的DNA修復(fù)通路會識別損傷并啟動修復(fù)【4】。

首先，一部分DNA雙鏈斷裂會被末端直連修復(fù)（非精準(zhǔn)修復(fù)），其中一些會造成損傷位點附近的突變；在基因編輯領(lǐng)域，我們稱之為序列增刪 (indels)，這也是經(jīng)常被用來衡量CRISPR/Cas9切割效率的標(biāo)志。其次，會有一部分?jǐn)嗔训哪┒宋茨苤边B修復(fù)，則會被一些酶加工/切除，如果這部份被加工的末端隨后被末端連接修復(fù)，則會造成片段缺失；這一可控步驟在DNA修復(fù)領(lǐng)域被稱為強切除 (Extensive resection)，集中在斷裂的±3 kb左右【5】，所以Bradley及其同事在Cas9切割位點附近5500 bp的區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的片段缺失 。這部份加工后的末端也可能被精準(zhǔn)修復(fù)，即同源末端重組，修復(fù)后的產(chǎn)物在Bradley及其同事的檢測方法中不可見。再次，有很少一部分DNA末端的加工能延長至100 kb甚至更遠(yuǎn)的范圍，被稱為長程切除 (Long resection)，其被末端連接修復(fù)會造成大片段缺失【5-7】，其中部分跟也被Bradley及其同事發(fā)現(xiàn)。最后，DNA斷裂的兩個末端可能失去拴綁的紐帶，各自與基因組上的其它損傷末端連接形成染色體易位等更復(fù)雜結(jié)構(gòu)【5,8】，這部份被Bradly及其同事預(yù)測到。

關(guān)于CRISPR/Cas9造成的各種染色體異常結(jié)構(gòu)，筆者及同事在2015年發(fā)表在Nature Biotechnology的論文中利用開發(fā)的高通量CRISPR/Cas9脫靶活性檢測方法 (LAM-HTGTS) 也鑒定過并有系統(tǒng)的描述，包括片段缺失、插入、倒置、染色體易位、雙著絲粒染色體等【5】。Bradley他們及我們的工作表明，對CRISPR/Cas9脫靶活性的關(guān)注，不僅僅要關(guān)注具有相似序列的脫靶位點上，還應(yīng)涉及到其它各種染色體異常結(jié)構(gòu)。

目前看來，CRISPR/Cas9造成的基因組DNA雙鏈斷裂可能給細(xì)胞群帶來一些染色體異常結(jié)構(gòu)，因此其并不能直接運用于人體。但筆者覺得眼前至少有兩種方案可能有助于規(guī)避這種異常：一是從CRISPR/Cas9處理過的細(xì)胞群中通過篩選的方法篩到不含有異常結(jié)構(gòu)的細(xì)胞并進行擴大培養(yǎng)，但須防止篩選到p53抑癌基因缺失的細(xì)胞【9,10】；二是單堿基修飾酶 (Base editor)，其作用不依賴于DNA雙鏈斷裂，但其脫靶活性仍待進一步鑒定。

參考文獻：

1. K. R. Anderson et al., CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.Nat Methods,  (2018).

2. Michael Kosicki et al., Repair of CRISPR–Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol,  (2018).

3. S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna, DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507, 62-67 (2014).

4. Frock RL, Hu J, Alt FW. Mechanisms of recurrent chromosomal translocations. In book: Chromosomal translocations and genome rearrangements in Cancer. Springer International Publishing, ISBN: 978-3-319-19983-2.

5. R. L. Frock et al., Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nat Biotechnol 33, 179-186 (2015).

6. R. Chiarle et al., Genome-wide translocation sequencing reveals mechanisms of chromosome breaks and rearrangements in B cells. Cell 147, 107-119 (2011).

7. I. A. Klein et al., Translocation-capture sequencing reveals the extent and nature of chromosomal rearrangements in B lymphocytes. Cell 147, 95-106 (2011).

8. J. Hu et al., Detecting DNA double-stranded breaks in mammalian genomes by linear amplification-mediated high-throughput genome-wide translocation sequencing. Nat Protoc11, 853-871 (2016).

9. E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale, CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, (2018).

10. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells.Nat Med 24, 939-946 (2018).