細(xì)胞凋亡，以前也稱細(xì)胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理?xiàng)l件下，細(xì)胞主動(dòng)的、高度有序的、自己結(jié)束其生命的過程。細(xì)胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現(xiàn)象，胚胎形成、個(gè)體發(fā)育、衰老和損傷細(xì)胞的清除等都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實(shí)驗(yàn)等。而流式細(xì)胞術(shù)是非常重要的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。

細(xì)胞凋亡可分為早期凋亡（細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，磷酯酰絲氨酸外翻）、早中期凋亡（細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素c、到胞漿）、中晚期凋亡（細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、晚期凋亡（DNA降解為180-200bp片斷）。

細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)方法匯總：下面我們一一進(jìn)行介紹。

一、用的最多的Annexin V /PI雙染色法檢測(cè)早期凋亡

正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱的，活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化， PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin V是一種對(duì)PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS, 而活細(xì)胞的PS位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無法與Annexin V特異性結(jié)合。所以可以用FITC偶聯(lián)的annexin V鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。

壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS, 所以Annexin V無法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整， PI染料無法自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

操作方法（以懸浮細(xì)胞為例）

1、細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞于1.5EP管中，4°C，350g離心5min，棄上清，用500ul預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次；

2、分別加入5μl AnnexinV+5μlPI +95μl AnnexinV Bind Buffer（含鈣離子的緩沖液）重懸細(xì)胞，室溫、避光20min;

3、向每個(gè)管中加入200μl的AnnexinV Bind Buffer,盡快上機(jī)檢測(cè)。

4、對(duì)照組的設(shè)置：

（1）空白對(duì)照：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加熒光劑，用來調(diào)電壓；

（2）單染對(duì)照：只加PI或AnnexinV（FITC），用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

（3）陽(yáng)性對(duì)照：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光試劑，確認(rèn)試劑、儀器、操作沒有問題；

（4）陰性對(duì)照：正常細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光試劑，確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài)，排除假陽(yáng)性。

5、上機(jī)操作時(shí)也是先調(diào)節(jié)電壓，再調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

結(jié)果分析

橫坐標(biāo)為AnnexinV強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為PI強(qiáng)度，對(duì)AnnexinV來說，十字門左邊是陰性細(xì)胞群，右邊是陽(yáng)性細(xì)胞群；對(duì)PI來說十字門上邊是陽(yáng)性細(xì)胞群，下邊是陰性細(xì)胞群。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

（1）貼壁細(xì)胞如何處理？

對(duì)于貼壁細(xì)胞，凋亡染色，用不含EDTA的0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液即可，其他參考懸浮細(xì)胞操作方法，控制消化時(shí)間，過渡消化會(huì)損傷細(xì)胞。

（2）做流式凋亡是否需要調(diào)節(jié)補(bǔ)償？

如果使用的是相鄰?fù)ǖ赖臒晒馑?，要調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

（3）凍存過的細(xì)胞樣本，還可以做流式凋亡檢測(cè)嗎？

不建議采用凍存過的細(xì)胞樣本，盡量使用新鮮的樣本。

（4）保證細(xì)胞活性，避免用力吹打，預(yù)冷PBS清洗，縮短上機(jī)時(shí)間，可上機(jī)前5min再加PI；

（5）血小板含有PS，能與AnnexinV結(jié)合，故需除去

（6）結(jié)果分析需依據(jù)對(duì)照比較

二、細(xì)胞凋亡---線粒體膜電位檢測(cè)

JC-1是親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。正常生理狀態(tài)下，線粒體負(fù)電性高，JC-1進(jìn)入線粒體以多聚體存在，紅色熒光強(qiáng)，細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體去極化產(chǎn)生，負(fù)電性降低，JC-1則以單體存在細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

（1）37°C 培養(yǎng)箱中孵育；

（2）JC-1工作液現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）PH的變化影響膜電位，保持平衡染液中PH的一致性；

（4）JC-1會(huì)與蛋白結(jié)合，降低燃料的濃度，引起假去極化；

（5）用補(bǔ)償微球或借用FITC-PI的補(bǔ)償。

三、細(xì)胞凋亡—活化的caspase-3檢測(cè)

活化的caspase-3由其前體裂解的一個(gè)17KD亞單位和一個(gè)12KD亞單位組成，形成異二聚體，可被Anti-Active Caspase-3抗體特異性識(shí)別。用熒光素標(biāo)記Anti-Active Caspase-3抗體即可檢測(cè)到活化的Caspase-3。

實(shí)驗(yàn)流程（以懸浮細(xì)胞為例）

1、細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞于1.5EP管中，4°C，350g離心5min，棄上清，用500ul預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次；

2、固定細(xì)胞，洗滌之后加入破膜劑（破胞膜）；

3、加入熒光素標(biāo)記Anti-Active Caspase-3抗體，進(jìn)行胞內(nèi)抗體染色，室溫30min；

4、加破膜劑洗滌之后，F(xiàn)ACS buffer重懸細(xì)胞，流式上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果分析

橫坐標(biāo)為活化的Caspase-3強(qiáng)度，活化的Caspase-3陽(yáng)性的細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞（紅色部分）。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

（1）固定破膜之后細(xì)胞會(huì)損失，前期可以多收集一些細(xì)胞。

四、細(xì)胞凋亡—DNA片段化的檢測(cè)

細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180~200bp及其整數(shù)倍的寡核苷酸片段,。DNA一旦發(fā)生片段化，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)上會(huì)出現(xiàn)很多缺口，可以使用FITC標(biāo)記的DUTP或BrdU在酶的作用下?lián)饺氲饺笨谥?，然后檢測(cè)摻入的信號(hào)強(qiáng)度，來判斷發(fā)生片段化的程度。

實(shí)驗(yàn)流程：跟上面提到的步驟差不多，在此不做贅述。

固定-洗滌-FITC-dUTP染色-洗滌-PI/Rnase染色-上機(jī)檢測(cè)

結(jié)果分析

橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為Brdu強(qiáng)度，Brdu陽(yáng)性的細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。