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背景介紹 盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱氨酸蛋白酶在凋亡執(zhí)行過程中起著至關(guān)重要的作用，而且細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase被活化并發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，Caspase家族蛋白存在于胞漿中，它們同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，均含有一個半胱氨酸激活位點(diǎn)，特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵，目前被發(fā)現(xiàn)的Caspases有14種，它們參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，此外還參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和運(yùn)動。 1 Caspases家族 哺乳動物Caspase家族蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，可以分為三大類（圖1）： 第一類：促凋亡Caspases 主要包括Caspase-2，8，9，10，3，6，7。它們以級聯(lián)放大的方式對胞內(nèi)蛋白進(jìn)行高效切割，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它們被分為兩派，其中Caspase 2，8，9，10參與細(xì)胞凋亡的起始（啟動者，initiators）;Caspase 3，6，7參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行（效應(yīng)者，effectors）。 第二類：促炎性Caspases 主要包括Caspase-1，4，5，11，12，13。在先天性免疫應(yīng)答激活期間，促炎性Caspases介導(dǎo)特異性細(xì)胞因子（cytokines）的成熟，如Pro-IL-1β和Pro-IL-18，形成有活性的IL-1β和IL-18；但也可能參與一種稱為pyroptosis（焦亡）的細(xì)胞死亡形式。 第三類：角化細(xì)胞分化 圖1：Caspase家族圖譜。圖片來源于網(wǎng)絡(luò) 2 Caspases活化 細(xì)胞中合成的Caspases以無活性的酶原狀態(tài)存在，經(jīng)過活化后方能執(zhí)行剪切功能。Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。需在兩個亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割，結(jié)果產(chǎn)生了由兩個亞基組成的異二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。通常N-末端的肽在活化時也被除去，但對于Caspase-9是否去除N-末端肽對活性無影響。 3 凋亡執(zhí)行 Caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們異源活化后降解PARP，DFF-45(DNA fragmentation factor-45)，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解。而Caspase-6的底物是lamin A（詳情請點(diǎn)擊往期推文：爆款產(chǎn)品-明星分子Lamin A/C重組兔單抗）和keratin 18，它們的降解導(dǎo)致核纖層和細(xì)胞骨架的崩解。 4 細(xì)胞凋亡的檢測方法 細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞死亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。 細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。 方法一：形態(tài)學(xué)檢測 以顯微鏡觀察細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞層面的形態(tài)變化和形態(tài)學(xué)特征，而具體的顯微鏡技術(shù)以及其所檢測的凋亡形態(tài)學(xué)特征見下圖（圖2）： 圖2：顯微鏡技術(shù)及其檢測的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)特征。圖片來源于網(wǎng)絡(luò) 方法二：流式細(xì)胞術(shù)檢測（FCM, Annexin V-PI雙染色實(shí)驗(yàn)） 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布于細(xì)胞膜磷脂雙分子層內(nèi)側(cè)，細(xì)胞處于凋亡早期時，PS發(fā)生外翻出現(xiàn)在細(xì)胞外側(cè)，Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，可與PS高度親和，因而Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡晚期和死細(xì)胞中，PI可透過細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合。Annexin V和PI配合使用，可以將凋亡早期細(xì)胞和晚期細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。 Annexin V-PI雙染實(shí)驗(yàn)可將細(xì)胞分為四種類型（圖3） 圖3：Annexin V-PI雙染色實(shí)驗(yàn) B3象限：Annexin V陰性且PI陰性（雙陰性細(xì)胞）：活細(xì)胞； B4象限：Annexin V陽性且PI陰性：早期凋亡細(xì)胞； B2象限：Annexin V陽性且PI陽性（雙陽性細(xì)胞）：晚期凋亡細(xì)胞； B1象限：Annexin V陰性且PI陽性：壞死細(xì)胞。 3.核酸電泳檢測（DNA片段檢測法） 細(xì)胞凋亡時DNA會發(fā)生片段化，形成200bp的整數(shù)倍；而壞死細(xì)胞時DNA發(fā)生無規(guī)則斷裂。因而在凝膠電泳中，如果出現(xiàn)這種顯著特征的電泳條帶，就可以判斷細(xì)胞發(fā)生了凋亡。 圖4：DNA片段凝膠電泳 4. mRNA水平的檢測 科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和Bcl-xL作為抗凋亡的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。因而可以用qPCR技術(shù)（詳情請點(diǎn)擊往期推文：新款通用型qPCR mix，專治各種不服 & 新品上市--Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix）來檢測Fas, Bax 和 Bcl-xL基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。 5. 細(xì)胞色素C的定位檢測 細(xì)胞色素C（Cytochrome C）作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合Apaf-1（Apoptotic protease activating factor-1）后啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)。因而可以通過組化或熒光方法檢測Cytochrome C定位來判斷細(xì)胞凋亡。 6. 凋亡明星分子檢測 通常以Western Blot檢測凋亡通路明星蛋白，如Caspase家族蛋白，Caspase 8，Caspase 6，和Caspase 3的前體和剪接體，以及Caspase 3的底物PARP分子；又如Bcl-2家族蛋白，抑制凋亡的Bcl-2和促進(jìn)凋亡的Bax，在以Western Blot檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)量后，通過Bcl-2/Bax的比值，可表征細(xì)胞凋亡的程度。 圖5：ABclonal第四代重組兔單抗制備流程 |
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