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細(xì)胞周期是指細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)間，它代表著生命從一代向下一代傳遞的連續(xù)過程，與前幾期我們介紹過的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖、克隆形成等）一樣，細(xì)胞周期也是評價(jià)細(xì)胞增殖功能的重要實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀是檢測細(xì)胞周期最常用的方法，然而我們會(huì)碰到細(xì)胞量不夠、細(xì)胞碎片太多等原因，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)一次次重復(fù)，本文就一起看看如何把細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)變的更加漂亮，準(zhǔn)確！
一、細(xì)胞周期簡介
主要分為以下2大過程： 分裂間期：間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）； 分裂期M期：細(xì)胞分裂期，指細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。
細(xì)胞周期圖（來自網(wǎng)絡(luò)）
注：G0期是指某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后會(huì)暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂；但在一定適宜刺激下，又可進(jìn)入周期； 因?yàn)榉至验g期持續(xù)的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)比分裂期持續(xù)時(shí)間長，在一個(gè)正常細(xì)胞周期中，分裂間期時(shí)間會(huì)占整個(gè)細(xì)胞周期的90%～95%； 不同類型細(xì)胞的G1期時(shí)間長短不同，所以其細(xì)胞周期時(shí)間存在差異。如：人類胃上皮細(xì)胞為24小時(shí)，骨髓細(xì)胞為18小時(shí)，HeLa細(xì)胞為21小時(shí)。
二、常用的實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞周期常用檢測方法有流式檢測法、BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)摻入法及同位素標(biāo)記法等，其中流式檢測法因適用于大量樣品檢測，可快速分析單個(gè)細(xì)胞的多種特性，是目前最為常用的測定細(xì)胞周期的一種方法，下面就詳細(xì)介紹如何利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期分析。
1. 流式檢測的實(shí)驗(yàn)原理
由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，因此，可通過特異性與DNA結(jié)合染料來檢測細(xì)胞內(nèi)的DNA含量來測定細(xì)胞周期。流式中常用碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。因此，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，同時(shí)獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。
2. 流式細(xì)胞儀的實(shí)驗(yàn)步驟
A. 收集細(xì)胞 取適量的對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6cm中，在相應(yīng)的條件下（如藥物）處理相應(yīng)時(shí)間后，倒去培養(yǎng)基，用胰酶適度消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，棄去上清；
Tips: 細(xì)胞數(shù)量：一般情況下，由于在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1.0*104~3.0*104才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，單次流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)，1份樣品的細(xì)胞數(shù)量至少為106； 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間：一般藥物等處理時(shí)間最好是大于細(xì)胞增殖一代的周期，可根據(jù)具體細(xì)胞分裂時(shí)間決定，如乳腺癌細(xì)胞我們一般處理24h。
B. 清洗及固定細(xì)胞 用PBS清洗細(xì)胞2遍，吸凈離心管殘余的PBS后，加入300μL PBS重懸，將細(xì)胞吹散，避免細(xì)胞成團(tuán)。隨后將細(xì)胞懸液逐滴滴入700μL無水乙醇（預(yù)冷），即用70-75%的乙醇固定細(xì)胞，然后4℃固定過夜。
Tips:
C. 洗滌細(xì)胞 次日，離心收集細(xì)胞，用移液槍吸走上清，然后用1mL PBS重懸細(xì)胞并離心清洗2~3遍。
Tips:
D. RNA酶消化和PI染色 在避光條件下，每個(gè)樣品加入1避光 RNase （10mg/mL）和5和mg/m（5mg/mL）混勻后室溫避光條孵育30min。
E. 上機(jī)檢測 將檢測樣品轉(zhuǎn)移到5mL的流式管后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，采用flowjo或modifit軟件進(jìn)行DNA含量分析。
Tips: 3. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
常用的流式檢測法分析細(xì)胞周期的方法是根據(jù)細(xì)胞DNA含量（橫坐標(biāo)）結(jié)合縱坐標(biāo)的細(xì)胞數(shù)量來分析的，如下的乳腺癌細(xì)胞系T47D細(xì)胞周期分布圖：
 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞周期分布圖
圖形區(qū)（左側(cè)）
G0/G1期：流式檢測結(jié)果圖的第一個(gè)峰；G1期是DNA含量最少的時(shí)期，DNA復(fù)制還沒有開始；G0期是細(xì)胞靜止期，不復(fù)制DNA，無法與G1期分開，所以報(bào)告為G0/G1期；
S期：在流式結(jié)果圖中顯示為第二個(gè)不高但很寬的峰；此時(shí)期細(xì)胞開始復(fù)制到完成復(fù)制，是一個(gè)一倍DNA到二倍DNA的過程；
G2/M期：流式檢測結(jié)果圖的第三個(gè)峰。G2期是DNA復(fù)制完成至分裂的一段時(shí)間，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)含二倍DNA；M期是細(xì)胞分裂的過程，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)是二倍DNA，無法與G2期分開，所以報(bào)告為G2/M期。
數(shù)據(jù)分析區(qū)（右側(cè)紅方框）
各時(shí)期比值：Dip G1-45.66% at 49.04表示G1期DNA含量平均值為49.04（2N），占細(xì)胞總數(shù)的45.66%。同理，Dip G2-15.12% at98.08則表示G2期DNA含量平均值為98.08（4N），占細(xì)胞總數(shù)的15.12%。以此類推，可以得知S期和G2/G1期的百分比；
CV：表示峰的變異系數(shù)，一般CV越小，峰形越好，越尖銳；能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就被認(rèn)可了。
Debris：表示細(xì)胞碎片，越少越好；
其他：Aggregates：表示細(xì)胞聚集體;Modeled events：表示儀器檢測到的總細(xì)胞數(shù)；All cycle events：表示在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)（即排除了細(xì)胞碎片和聚集體）
舉例：如常用于研究藥物或者基因等對細(xì)胞周期阻滯的影響
通過比較Control組和藥物組，發(fā)現(xiàn)化合物影響乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231的細(xì)胞周期分布，處理組的G2/M期峰值變高，即G2/M期細(xì)胞數(shù)量增多，即藥將其阻滯在G2/M期。注：對于未處理的細(xì)胞一般都是分裂間期時(shí)間比分裂期長，即G1-S期＞M期。
藥物處理MDA-MB231細(xì)胞后的周期分布圖[2]
常見問題解答
是否可以直接用70~75%的乙醇固定細(xì)胞？ 不可以，直接70~75%乙醇加入很容易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞，影響固定效果，甚至容易導(dǎo)致固定后無細(xì)胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是：待細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙醇。
上機(jī)細(xì)胞量過少，無法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果？ 首先，要保證收集足夠的細(xì)胞樣品（個(gè)人經(jīng)驗(yàn)至少收集100萬左右）；如果藥物處理后細(xì)胞死亡過多，應(yīng)該降低藥物濃度； 其次，固定細(xì)胞時(shí)先用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再逐滴滴入無水乙醇中； 細(xì)胞清洗時(shí)，不可過度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片； 最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機(jī)，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點(diǎn)，不要吸完；
什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用？ G2/M期細(xì)胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個(gè)2倍于G1信號峰的高斯峰； CV(變異系數(shù))表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認(rèn)可。 RCS最好是在1~3，高于5則不被認(rèn)可。RCS高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時(shí)候RNA酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。
在實(shí)驗(yàn)操作過程中，如何提高G0/G1峰分辨率和精確度？ 變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。細(xì)胞碎片越少、細(xì)胞聚團(tuán)越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精確度。
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