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大家總是想讓自己的實驗數(shù)據(jù)有不動聲色的高級感，流式細(xì)胞儀檢測就是細(xì)胞生物學(xué)的必備高級技能。周期實驗是檢測藥物、基因或蛋白對細(xì)胞周期影響的一種檢測方法，具體要怎么做呢？且聽我道來。 實驗原理 細(xì)胞周期（Cell Cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個子細(xì)胞。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。 表1 細(xì)胞周期 細(xì)胞周期 | 特征 | 間期 | G1期 | DNA合成前期 | S期 | DNA合成期 | G2期 | DNA合成后期 | 分裂期 | M期 | 有絲分裂前、中、后、末期 | G0期 | 分裂結(jié)束后暫時離開細(xì)胞周期 |
流式細(xì)胞儀用PI染色法檢測細(xì)胞周期。由于細(xì)胞周期各時相的DNA 含量不同,通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此,通過流式細(xì)胞儀PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為G1/G0 期，S期和G2/M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過軟件計算各時相的細(xì)胞百分率（如圖1所示）
圖1 流式周期檢測圖說明 技術(shù)應(yīng)用 檢測異倍體的腫瘤細(xì)胞，檢測藥物、基因或蛋白等對細(xì)胞周期的影響。 實驗步驟 1. 細(xì)胞收集： 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按1×106cells/ ml以1 ml接種24孔板或2 ml接種于6孔板內(nèi)，進行所需的處理（比如加入藥物），特定時間后終止培養(yǎng)，用常規(guī)胰酶消化并收集于離心管中，然后用 PBS洗滌細(xì)胞2-3次，制備成單細(xì)胞懸液。2. 細(xì)胞固定： 1000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，棄上清，用PBS洗滌兩次后加入250 μl PBS使細(xì)胞重懸，再逐滴加入750 μl預(yù)冷的無水乙醇（-20℃），使其終濃度為 75% 4℃放置過夜固定。3. 細(xì)胞標(biāo)記： a) 次日，取出已固定的樣品，1000 rpm離心5 min，棄上清，用1 ml的PBS洗滌兩次，加入300 ulRNase A（200 ug/ml溶于PBS ）重懸，37℃消化30min。 b) 加入100 ul溴化乙錠（PI，50ug/ml）工作液，4℃避光孵育30min。 4. 流式分析： 轉(zhuǎn)至流式檢測管用流式細(xì)胞儀檢測，PI用488nm氬離子激光器激發(fā)，由630帶通濾光片接受，通過FSC/SSC散點圖收集細(xì)胞，排除粘連細(xì)胞和碎片后分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。 吉瑪周期檢測實例 由以下檢測結(jié)果可以得出，siRNA干擾實驗組相比比空白和陰性對照組處于S期的細(xì)胞數(shù)量降低，而處于G1期的細(xì)胞數(shù)量增加，可見細(xì)胞復(fù)制受到了阻滯。 
圖2周期檢測 （B，空白細(xì)胞組；NC陰性對照組；siRNA干擾組：某基因的干擾序列處理組）
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