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科研工具丨作圖丨實(shí)驗(yàn)丨SCI丨統(tǒng)計(jì)分析丨國(guó)自然 細(xì)胞周期（cell cycle）是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開(kāi)始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過(guò)程。在這一過(guò)程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。與前幾期我們介紹過(guò)的克隆形成等實(shí)驗(yàn)一樣，細(xì)胞周期也是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖功能的重要實(shí)驗(yàn)，可反映細(xì)胞增殖的速度。細(xì)胞周期主要分為分裂間期和分裂期（M期）2大過(guò)程。而分裂間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。G1期主要合成RNA和核糖體，細(xì)胞體積明顯增大。 S期除了合成DNA外，還要合成組蛋白以及DNA復(fù)制所需的酶。 G2期是有絲分裂的準(zhǔn)備期，DNA合成終止，大量合成RNA包括微管蛋白和促成熟因子等。 - M期細(xì)胞分裂，DNA由二倍體重新成為一倍體。
注：G0期是指某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后會(huì)暫時(shí)離開(kāi)細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂；但在一定適宜刺激下，又可進(jìn)入周期。（源自互聯(lián)網(wǎng)）分裂間期持續(xù)的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)比分裂期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在一個(gè)正常細(xì)胞周期中，分裂間期時(shí)間會(huì)占整個(gè)細(xì)胞周期的90%～95%；細(xì)胞周期研究的應(yīng)用細(xì)胞周期的研究對(duì)于深入了解生物的生長(zhǎng)發(fā)育和控制腫瘤生長(zhǎng)等有重要意義。細(xì)胞周期失調(diào)是癌癥的主要特征之一。有資料表明腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病，因此在腫瘤生物學(xué)及腫瘤藥理學(xué)領(lǐng)域?qū)δ[瘤細(xì)胞周期的分析對(duì)腫瘤生物學(xué)特征及腫瘤藥物作用機(jī)制的研究具有重要的意義。? 在腫瘤病理學(xué)研究中，通常以S期細(xì)胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標(biāo)。? 在腫瘤治療中，G0期細(xì)胞對(duì)化療不敏感，癌細(xì)胞難以被有效殺滅，往往成為日后癌癥復(fù)發(fā)的根源。因而可通過(guò)調(diào)控機(jī)理的研究，誘發(fā)G0期癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，提高化療敏感性，再合理用抗癌藥物加以殺滅，是防止癌轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的重要調(diào)控措施。 因此對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的研究，有助于闡明腫瘤的發(fā)生以及終末細(xì)胞的分化，將為治療腫瘤和誘導(dǎo)終末分化細(xì)胞的增殖提供有益的思路。細(xì)胞周期的檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測(cè)法、BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)摻入法等。其中流式檢測(cè)法因適用于大量樣品檢測(cè)，可快速分析單個(gè)細(xì)胞的多種特性，是目前最為常用的測(cè)定細(xì)胞周期的一種方法。下面詳細(xì)介紹?在細(xì)胞周期的不同時(shí)期，細(xì)胞核內(nèi)的DNA含量存在差異。通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。
因此，在流式檢測(cè)時(shí)，可以使用核酸染料染色后，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)判斷細(xì)胞處于哪一時(shí)期。流式中常用碘化丙啶（Propidium，簡(jiǎn)稱PI）與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量————DNA含量多，熒光強(qiáng)度高，DNA含量少，熒光強(qiáng)度低。（1）細(xì)胞培養(yǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×106 cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種于6孔板內(nèi)，進(jìn)行所需的處理（比如加入藥物），特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。Ps：建議選擇6孔板操作，細(xì)胞給藥密度在60%左右 （2）收集細(xì)胞：倒去培養(yǎng)基，用胰酶適度消化細(xì)胞，800rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀，棄去上清。（3）細(xì)胞固定：用預(yù)冷PBS洗滌1-2次，吸凈離心管殘余的PBS后，加入300μL PBS重懸，將細(xì)胞吹散，避免細(xì)胞成團(tuán)。隨后將細(xì)胞懸液逐滴滴入－20℃ 預(yù)冷的75%乙醇，邊加邊高速攪拌，避免細(xì)胞粘連在一起，置于-20°C冰箱固定過(guò)夜。Ps：由于流式分析時(shí)需要的是單個(gè)細(xì)胞懸液，因此在操作過(guò)程中需充分混懸細(xì)胞；細(xì)胞固定后，不可過(guò)度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片。 （4）細(xì)胞染色：染色當(dāng)天取出標(biāo)本，800rpm離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌1-2次，加入400μL溴化乙錠（PI，50μg/mL），100μl RNase A（100ug/mL），4℃避光孵育60min。Ps：棄去乙醇溶液此時(shí)格外需要注意的是，離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會(huì)存在大量細(xì)胞，去上清一定要注意。 （5）流式分析：以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，一般計(jì)數(shù)2~3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。Ps：上機(jī)前要以50μm尼龍網(wǎng)膜或35μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞！因?yàn)镻I具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)！上機(jī)檢測(cè)時(shí)，必須重懸成細(xì)胞懸液后再檢測(cè)，否則容易堵儀器管道。 
（1）縱坐標(biāo)Cell Number：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)；（2）橫坐標(biāo)DNAContent：即DNA含量；（3）分析細(xì)胞周期的方法是依據(jù)細(xì)胞DNA含量（橫坐標(biāo)）來(lái)分析的：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值為55.56；53.84%即G1期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值為107.72，5.64%即G2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的5.64%；以此類推… CV：變異系數(shù)（Coefficient of Variation）反映G0/G1峰分辨率和精確度，是評(píng)價(jià)周期結(jié)果好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳，質(zhì)量越好；能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就被認(rèn)可了。
5、什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用？? G2/M期細(xì)胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個(gè)2倍于G1信號(hào)峰的高斯峰；? CV(變異系數(shù))表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認(rèn)可。? RCS最好是在1~3，高于5則不被認(rèn)可。RCS高，說(shuō)明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時(shí)候RNA酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。 雖然此檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，僅需簡(jiǎn)單的固定染色即可進(jìn)行檢測(cè)，但很多同學(xué)做出來(lái)的結(jié)果還是不夠理想。影響CV的因素主要包括兩方面：儀器因素（如液流、光路、機(jī)器調(diào)試等）和樣本制備及染色過(guò)程對(duì)標(biāo)本的人為影響。在進(jìn)行分析時(shí)應(yīng)盡量減少這兩大因素帶來(lái)的變異。CV值過(guò)大的異常原因及相應(yīng)解決方案如下：? 首先要確定我們所檢測(cè)的細(xì)胞是能夠進(jìn)行分裂增殖的，如：外周血淋巴細(xì)胞在正常情況下基本都是不會(huì)進(jìn)行增殖的，處于G0期。? 此外，如果細(xì)胞培養(yǎng)條件不對(duì)或營(yíng)養(yǎng)不足，引起細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，也會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞進(jìn)入G0期。此時(shí)需及時(shí)優(yōu)化培養(yǎng)條件，否則時(shí)間一長(zhǎng)會(huì)引起細(xì)胞狀態(tài)變差，直至細(xì)胞死亡。? 還有就是，很多細(xì)胞生長(zhǎng)密度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制，同樣會(huì)導(dǎo)致G2/M期缺失。所以，在進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要保證檢測(cè)時(shí)細(xì)胞尚有合理的生長(zhǎng)空間。■ 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)/注意事項(xiàng)下面小編帶大家來(lái)看看細(xì)胞周期檢測(cè)中的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)/注意事項(xiàng)，希望大家都能夠做出理想的檢測(cè)結(jié)果。制備單細(xì)胞懸液：操作應(yīng)輕柔，減少碎片，較多的碎片會(huì)干擾S 期的計(jì)算，也會(huì)妨礙分析較小的亞二倍體峰。大量的壞死或凋亡細(xì)胞也會(huì)帶來(lái)過(guò)多碎片，在樣品制備過(guò)程中應(yīng)盡量避免。 利用RNase消除細(xì)胞周期檢測(cè)中RNA的影響：PI是一種插入性核酸熒光染料，能選擇性地嵌入核酸DNA雙鏈螺旋的堿基之間并發(fā)出熒光，但也可以插RNA的雙鏈區(qū)，非 DNA特異性，所以需加入RNase消除RNA的影響； 進(jìn)行DNA染色時(shí)不要洗滌：不同于蛋白質(zhì)染料和細(xì)胞之間的牢固結(jié)合，DNA與染料的結(jié)合，是一種結(jié)合態(tài)與游離態(tài)之間松散的平衡，洗滌步驟會(huì)造成染料丟失，降低核酸的特異性熒光，造成測(cè)量值降低； 最低速度上機(jī)檢測(cè)：進(jìn)樣速度為低速，避免儀器把相鄰細(xì)胞當(dāng)作一個(gè)細(xì)胞。流速越高，CV值越大。若峰形較寬，可能就是進(jìn)樣速度太快。因此，進(jìn)行DNA分析時(shí)，盡量采用最低流速10μL/min-12.5μL/min進(jìn)行檢測(cè)。 儀器質(zhì)控定期做，盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬； 在進(jìn)行周期實(shí)驗(yàn)時(shí)，需采用PI-A + PI-H來(lái)排除粘連體：黏連體是指一起通過(guò)激光照射區(qū)而被錯(cuò)誤地記錄為一個(gè)細(xì)胞的兩個(gè)細(xì)胞或顆粒。在DNA 分析中，兩個(gè)具有2N DNA 含量的細(xì)胞同時(shí)通過(guò)激光照射區(qū)，即被記錄成一個(gè)4N 的熒光信號(hào)，造成4N 的細(xì)胞增多的假象。胞黏連體過(guò)多會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成影響，應(yīng)在樣本制備時(shí)盡量避免。在跑樣過(guò)程中，需要對(duì)樣本進(jìn)行混勻，對(duì)于高通量進(jìn)樣來(lái)說(shuō)，吹吸混勻的效果要好于振蕩和攪拌混勻。 - PI的坐標(biāo)選線性：線性更能體現(xiàn)DNA含量的倍數(shù)關(guān)系。在DNA含量分析中，G2+M峰的數(shù)值應(yīng)該是G0/G1峰的兩倍。G0/G1峰和G2+M峰的位置提供了比較其他峰位置的基準(zhǔn)。一般情況下，G2/M與G1的比值需介于1.95-2.05之間。
由于PI具有黏性，通常周期實(shí)驗(yàn)放在最后做，否則需要深度清洗后，再進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。
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