|
——簡(jiǎn)介—— 自然界進(jìn)化出了眾多機(jī)理來(lái)結(jié)合無(wú)序蛋白或無(wú)序肽段，例如抗體antibody、主要組織相容性復(fù)合體MHCs、TPR蛋白結(jié)構(gòu)域等，盡管可以看到自然界的眾多手段，但是人工設(shè)計(jì)無(wú)序肽段（intrinsically disordered regions，IDRs）的binder仍然是極大的挑戰(zhàn)。尋找到針對(duì)IDRs強(qiáng)結(jié)合能力、高特異性binder的一般方法在生物學(xué)研究，疾病治愈與診斷中具有重大意義。 諾獎(jiǎng)得主David Baker在BioRxiv上發(fā)表兩篇文章"Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions"和"Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins"，開(kāi)發(fā)了IDRs的binder設(shè)計(jì)的一般方法。 這兩篇文章在預(yù)印本上發(fā)表數(shù)月有余，但仍然未有對(duì)其內(nèi)容的詳細(xì)介紹。本文將一探究竟在"Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions"中，Wu等人會(huì)如何實(shí)現(xiàn)對(duì)任意IDR序列設(shè)計(jì)強(qiáng)親和力和高特異性binder。 ——方法思路—— 
圖1. 關(guān)于IDRs的binder設(shè)計(jì)的主要流程Wu等人假設(shè)IDRs靶標(biāo)均能以舒展的構(gòu)象與形狀匹配的binder形成穩(wěn)定復(fù)合物。為此，他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)復(fù)合物模板庫(kù)，庫(kù)中IDRs（靶標(biāo)）以舒展的拉伸構(gòu)象參與結(jié)合，binder以形狀匹配的溝槽型口袋參與結(jié)合（圖1）。模板中IDRs參與結(jié)合的殘基數(shù)在4-30個(gè)，因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，他們將會(huì)沿IDRs靶標(biāo)的序列搜索最適于靶向的靶標(biāo)模板，再對(duì)該模板的復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和序列優(yōu)化，優(yōu)化后的復(fù)合物中的binder即為所設(shè)計(jì)的binder。要該方法發(fā)揮預(yù)期效果，需要滿足兩個(gè)條件：1）binder與IDRs靶標(biāo)結(jié)合的特異性可以由足夠的氫鍵提供，2）模板庫(kù)中有足夠的模板為任意IDRs靶標(biāo)提供至少一種其偏好的結(jié)合態(tài)構(gòu)象。具體來(lái)說(shuō)，該方法分為四步。第一步為“口袋生成”。作者為多種二肽重復(fù)序列構(gòu)建特異性、高親和力的口袋，再將這些口袋和對(duì)應(yīng)的二肽重復(fù)序列切斷，進(jìn)而得到結(jié)合單氨基酸、二肽或更長(zhǎng)序列的口袋。這些被設(shè)計(jì)的口袋的側(cè)鏈不僅可以與結(jié)合的氨基酸殘基的側(cè)鏈有相互作用，并且可以與其主鏈骨架存在氫鍵，以提供結(jié)構(gòu)的特異性及補(bǔ)償去溶劑化效應(yīng)。第二步為“口袋組裝”。作者將上步得到的口袋組裝，得到了能夠識(shí)別舒展構(gòu)象的溝槽型口袋。使用RFdiffusion重組生成口袋間的相互作用界面，并且要求產(chǎn)生整體剛性的結(jié)構(gòu)。至此產(chǎn)生了眾多口袋所組成的有著不同順序和幾何結(jié)構(gòu)的模塊。第三步為“穿連裝入”。將IDR靶標(biāo)序列映射到每個(gè)模版的靶標(biāo)骨架上，去尋找靶標(biāo)序列中最合適的結(jié)合模式。最后第四步“精修改善”。將產(chǎn)生的最佳匹配使用ProteinMPNN優(yōu)化序列并用AF2評(píng)估結(jié)構(gòu)。 第一、二步的模板文庫(kù)構(gòu)建完成后可被重復(fù)使用。針對(duì)新IDRs靶標(biāo)的binder設(shè)計(jì)則僅需進(jìn)行第三、四步，大大減少了計(jì)算的花費(fèi)。口袋生成基于之前超螺旋匹配的方式，聚焦于更加擴(kuò)展的氨基酸殘基構(gòu)象，多肽與蛋白的對(duì)接使用雙齒（bidentate）氫鍵相互作用，重復(fù)蛋白剩余序列使用ProteinMPNN優(yōu)化，設(shè)計(jì)的復(fù)合物使用Rosetta和AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)匹配模型。剛開(kāi)始選擇了LK、RT、YD、PV和GA等二肽，使用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后又用RFdiffusion對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，最后將二肽口袋拆分為單氨基酸口袋以覆蓋20種氨基酸殘基。為實(shí)現(xiàn)對(duì)非重復(fù)序列的識(shí)別，將定制的結(jié)合口袋組裝到新骨架上，用參數(shù)定位和 RFdiffusion連接生成設(shè)計(jì)，最后用口袋組裝構(gòu)建含識(shí)別極性殘基口袋的嵌合骨架，經(jīng)序列設(shè)計(jì)多樣化等操作，得到含340個(gè)模板的庫(kù)并擴(kuò)展至1000個(gè)成員。 針對(duì)內(nèi)在無(wú)序蛋白或區(qū)域，將其4-30氨基酸序列段匹配到目標(biāo)骨架上，使用ProteinMPNN優(yōu)化binder序列，對(duì) AF2指標(biāo)不佳的用RFdiffusion改進(jìn)。用此方法獲 21種相關(guān)靶標(biāo)的binder（含GPCR、胰島素、胰蛋白酶肽等配體），經(jīng)表達(dá)、純化及 BLI測(cè)結(jié)合，多數(shù)有納摩爾至皮摩爾親和力，還對(duì)部分binder進(jìn)一步優(yōu)化。這其中解析了dynorphin A結(jié)合復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)（結(jié)合力為7 nM）。
圖 2. 選擇的無(wú)序結(jié)構(gòu)及設(shè)計(jì)的binder的結(jié)合測(cè)定除此之外還通過(guò)Pull-Down等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了設(shè)計(jì)配體具有很好的特異性。總的來(lái)說(shuō)，Baker在"Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions"這篇文章中描述了以高親和力和特異性設(shè)計(jì)結(jié)合IDRs蛋白的方法，在43個(gè)靶標(biāo)中設(shè)計(jì)成功了39個(gè)，其中36個(gè)binder通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到，其中大部分親和力優(yōu)于100 nM。 在下一篇推送中將會(huì)介紹Baker針對(duì)IDP的binder設(shè)計(jì)的另一篇文章"Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins"。[1] Wu, K., Jiang, H., Hicks, D. R., Liu, C., Muratspahi?, E., Ramelot, T. A., ... & Baker, D. (2024). Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions. bioRxiv, 2024-07.
|
