長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200nt但無(wú)蛋白質(zhì)編碼潛能性的調(diào)控型RNA。很多客戶(hù)做完高通量lncRNA篩選之后，要針對(duì)某一特定的lncRNA進(jìn)行研究，這時(shí)就需要對(duì)該lncRNA的調(diào)控模式有一定的預(yù)估，可以通過(guò)FISH、免疫熒光等技術(shù)確定lncRNA的細(xì)胞位置，如位于胞漿，該lncRNA可能以”穩(wěn)定RNA”、“調(diào)節(jié)mRNA翻譯“、“ceRNA”、“充當(dāng)miRNA前體“或“介導(dǎo)蛋白”等方式發(fā)揮調(diào)控作用；若位于胞核，該lncRNA則以“順式作用”或“反式作用”兩種方式發(fā)揮調(diào)控作用。

案例一：典型順式

研究對(duì)象：lncTCF7        

靶標(biāo)基因：TCF7      

募集蛋白：SWI/SNF蛋白復(fù)合物

 

案例二：典型反式

研究對(duì)象：lncKdm2b   

靶標(biāo)基因：Zfb292    

募集蛋白：Stab1+NURF complex 



由此引發(fā)兩個(gè)問(wèn)題：
 

1. 如何尋找lncRNA的靶標(biāo)基因？

針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，方法可以有兩種：①實(shí)驗(yàn)方法；②生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。

①實(shí)驗(yàn)方法包括敲除或過(guò)表達(dá)，篩選差異mRNA來(lái)確定靶標(biāo)；或通過(guò)RNA-pull down結(jié)合測(cè)序/質(zhì)譜等技術(shù)確定靶標(biāo)；

②生物信息學(xué)預(yù)測(cè)包括通過(guò)位置關(guān)系和共表達(dá)分析來(lái)預(yù)測(cè)靶標(biāo)，預(yù)測(cè)結(jié)果需實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)一步驗(yàn)證。


 

2. 如何尋找lncRNA的結(jié)合蛋白？

針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，同樣有兩種方法：①實(shí)驗(yàn)方法；②生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。

①實(shí)驗(yàn)方法可通過(guò)RNA-pull down結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)確定靶標(biāo)；

②生物信息學(xué)預(yù)測(cè)目前公司還沒(méi)有成熟的分析產(chǎn)品（備注：轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合lncRNA的相互關(guān)系是可以分析滴），但可以給大家分享一個(gè)在線(xiàn)分析算法——catRAPID，在一些lncRNA文章中有使用該算法，它可以預(yù)測(cè)lncRNA與蛋白的結(jié)合關(guān)系。

由于網(wǎng)站使用存在權(quán)限，但可以提供給大學(xué)研究所等非營(yíng)利性機(jī)構(gòu)用于科學(xué)研究，但需和網(wǎng)站聯(lián)系獲取使用權(quán) ，有興趣的老師可以與相關(guān)機(jī)構(gòu)溝通。

接下來(lái)簡(jiǎn)單介紹一下catRAPID這個(gè)在線(xiàn)網(wǎng)站……………




    catRAPID算法用于計(jì)算蛋白質(zhì)與ncRNAs相互作用的能力（網(wǎng)址：http://service./page/catrapid_group）。該網(wǎng)站結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)、氫鍵、范德華力原理，以高精度預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)—RNA的結(jié)合關(guān)系。目前catRAPID分為多個(gè)模塊，各自的用途特點(diǎn)如下表：



   其中，catRAPID omics用于預(yù)測(cè)某一lncRNA（或蛋白）的結(jié)合蛋白（或lncRNA），可預(yù)測(cè)出大量候選，這一模塊對(duì)科研工作者很實(shí)用，其它模塊用于進(jìn)一步分析和評(píng)估某一特定lncRNA與某一特定蛋白的相互結(jié)合關(guān)系。

   catRAPID omics可用于預(yù)測(cè)某個(gè)lncRNA能和哪些蛋白結(jié)合，或者預(yù)測(cè)某個(gè)蛋白能和哪些lncRNA結(jié)合。使用者可以從RNA出發(fā)，也可以蛋白出發(fā)，只需知道lncRNA的核酸序列或蛋白質(zhì)的氨基酸序列即可：



1. 從lncRNA入手，以The long noncoding Xist repeat A region（簡(jiǎn)稱(chēng)RepA）為例，進(jìn)入RNA序列模塊，把RepA的序列信息輸入即可：



   輸入郵箱地址后開(kāi)始分析，分析完成后到郵件查看結(jié)果鏈接：



結(jié)果中最后一欄Ranking，通過(guò)星級(jí)將相互作用分為三等：高結(jié)合（3-2），中等結(jié)合（2-1），低結(jié)合（1-0）的蛋白都會(huì)非常詳細(xì)的展示出來(lái)，研究者就可以找到與RepA結(jié)合的蛋白。使用表格鏈接，用戶(hù)可以下載“所有交互的完整列表”。

2. 從蛋白入手，以TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) 為例，進(jìn)入蛋白序列模塊，把TDP-43的序列信息輸入，分析，獲取結(jié)果如下：包括圖和表兩種形式。


圖中黑線(xiàn)表示輸入分子，彩線(xiàn)表示識(shí)別并用于分析區(qū)域。表格根據(jù)其星級(jí)評(píng)分分為三個(gè)不同的類(lèi)別：高（3-2），中等（2-1），低（1-0）。
 

其它模塊可用于進(jìn)一步分析lncRNA與蛋白具體的結(jié)合信息，包括結(jié)合位點(diǎn)、相互作用傾向等等。

如catRAPID graphic模塊 :

顯示為熱圖。x軸和y軸分別表示RNA和蛋白質(zhì)序列的指標(biāo)。 熱圖的顏色表示單個(gè)氨基酸和核苷酸對(duì)的相互作用評(píng)分（范圍從-3到+3）。
 

如catRAPID fragments模塊：

1. 相互作用譜，表示沿著RNA序列（x軸）的蛋白質(zhì)的相互作用得分（y軸），提供關(guān)于最有可能被蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的信息。


2. 相互作用矩陣，其顯示了相互作用的蛋白質(zhì)（y軸）和RNA（x軸）區(qū)域的熱圖。熱圖中紅色的陰影表示單個(gè)氨基酸和核苷酸對(duì)的相互作用評(píng)分。

3. 表總結(jié)了前20個(gè)相互作用關(guān)系，結(jié)果展示了蛋白質(zhì)和RNA片段的坐標(biāo)、它們之間相互作用傾向以及每個(gè)相互作用的辨別力。

 

如catRAPID strength模塊：

下圖從左至右，分別是預(yù)測(cè)輸出標(biāo)識(shí)符、輸入標(biāo)識(shí)符，強(qiáng)度類(lèi)型，例數(shù)，得分Z值和蛋白質(zhì)的CDF（累積分布函數(shù)）。 CDF值表示交互傾向的意義。

 交互傾向的意義是針對(duì)三種不同的集合進(jìn)行評(píng)估：

-—相互作用→100個(gè)RNAs與100個(gè)蛋白質(zhì)的分布（104個(gè)相互作用）

—RNA→輸入蛋白與100個(gè)RNA的分布（102個(gè)相互作用）

—蛋白質(zhì)→輸入RNA與100種蛋白質(zhì)的分布（102種相互作用）


CDF分布圖形表示可點(diǎn)擊下載鏈接獲取：

 

下面我們來(lái)看幾個(gè)文章案例：

1. 一篇名為 《Long noncoding RNA MRAK009713 is a novel  regulator of neuropathic pain in rats》的文章利用高通量數(shù)據(jù)分析篩選出lncRNA—MRAK009713，發(fā)現(xiàn)它參與調(diào)控神經(jīng)性疼痛，通過(guò)CatRAPID算法發(fā)現(xiàn)MRAK009713與P2X3受體相互作用。然后經(jīng)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)： MRAK009713與P2X3蛋白直接相互作用，增強(qiáng)P2X3受體功能，是大鼠神經(jīng)性疼痛的新型正向調(diào)節(jié)劑。



2. 一篇名為《Identification of novel long non-coding RNAs in clear cell renal cell carcinoma》的文章通過(guò)lncRNA芯片（透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 vs 癌旁）和PCR驗(yàn)證篩選出11個(gè)差異倍數(shù)較高的lncRNA， 然后通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA-蛋白（catRAPID omics）相互作用，并對(duì)預(yù)測(cè)出的蛋白進(jìn)行功能通路分析，發(fā)現(xiàn)這些lncRNA與剪接，結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)，定位和處理有關(guān)。




3. 一篇名為《LncRNA NONRATT021972 siRNA normalized the dysfunction of hepatic glucokinase through AKT signaling in T2DM rats》，研究探討了lncRNA NONRATT021972小干擾RNA（siRNA）對(duì)肝GK功能障礙的影響，并采用生物信息學(xué)技術(shù)（CatRAPID）鑒定NONRATT021972 RNA的靶標(biāo)， 發(fā)現(xiàn)NONRATT021972與p-AKT之間存在相互作用。后期經(jīng)一系列實(shí)驗(yàn)確定NONRATT021972 siRNA增強(qiáng)了磷酸化AKT（pAKT）水平，GK表達(dá)和肝糖原合成，有效降低血糖水平。


4. 值得一提的是， catRAPID也可以用于預(yù)測(cè)circRNA與蛋白的相互關(guān)系，一篇名為 《Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans》的文章采用catRAPID算法預(yù)測(cè)Circ-ANRIL與PES1的相互結(jié)合關(guān)系。



以上幾篇文章都有采用catRAPID算法，給大家簡(jiǎn)單展示了如何尋找lncRNA結(jié)合蛋白以及l(fā)ncRNA與蛋白結(jié)合信息。當(dāng)然，該工具有使用權(quán)限，大家感興趣可以自己摸索摸索，自行與相關(guān)機(jī)構(gòu)溝通獲取使用權(quán)，里面還有好多寶貝等著大家去挖掘。
 

PS：

中康博可以提供： lncRNA與mRNA位置關(guān)系分析；lncRNA與mRNA共表達(dá)分析以及TF與lncRNA關(guān)系預(yù)測(cè)。
 

參考文獻(xiàn)：

1. Guilin Li et al. Long noncoding RNA MRAK009713 is a novel regulator of neuropathic pain in rats. PAIN. 2017.

2. Lesca M. Holdt et al. Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nature communications. 2016.

3. Shuangmei Liu et al. LncRNA NONRATT021972 siRNA regulates neuropathic pain behaviors in type 2 diabetic rats through the P2X7 receptor in dorsal root ganglia. .Molecular Brain .2016.

3. Jasmine JC Blondeau et al.  Identification of novel long non-coding RNAs in clear cell renal cell carcinoma. Clinical Epigenetics . 2015.

4. Davide Cirillo et al. Discovery of protein–RNA networks. Molecular BioSystems. 2014.

5. Davide Cirillo et al. Constitutive patterns of gene expression regulated by RNA-binding proteins. Genome Biology. 2014.

6. Davide Cirillo et al. Neurodegenerative diseases: Quantitative predictions of protein? RNA interactions. RNA. 2013.

7. Federico Agostini et al. X-inactivation: quantitative predictions of protein interactions in the Xist network. Nucleic Acids Research. 2013.

8. Davide Cirillo et al. Predictions of protein–RNA interactions. WIREs Comput Mol Sci. 2012.

9. Sylvain Maenner et al. 2-D Structure of the A Region of Xist RNA and Its Implication for PRC2 Association. PLoS Biology. 2010.