近幾年，新型抗腫瘤療法英雄輩出，但其中諸如免疫檢查點抑制劑已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，而嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）卻沒有得到同等待遇。
CAR-T在實體瘤上的疲軟是一方面，另一方面，CAR-T制備流程之復(fù)雜困難也是巨大的障礙。CAR-T制備過程中，如何安全有效地轉(zhuǎn)染基因是一大問題，T細胞對DNA轉(zhuǎn)染耐受很低，使得轉(zhuǎn)染后實際存活的細胞并不多，大大降低了生產(chǎn)效率。
近期，武漢大學(xué)中南醫(yī)院團隊提出了解決問題的新方法，研究者們發(fā)現(xiàn)，電穿孔轉(zhuǎn)染DNA的毒性是由cGAS-STING途徑介導(dǎo)的，而改變使用的緩沖液滲透壓能夠顯著抑制這一過程，將生產(chǎn)CAR-T的效率提升20倍，生成的CAR-T細胞抗腫瘤活性也高于傳統(tǒng)慢病毒方法。
該論文發(fā)表在《自然·生物醫(yī)學(xué)工程》上[1]。
論文題圖
目前市面上以及臨床試驗中使用的大多數(shù)CAR-T細胞，都是使用慢病毒載體遞送基因的。但是慢病毒載體存在隨機基因組整合問題，這既影響目標(biāo)基因的表達，也帶來了潛在的致癌風(fēng)險。
新的腺相關(guān)病毒（AAV）載體雖然能夠一定程度上提升CAR-T細胞的抗腫瘤效果，但是它也更加昂貴、復(fù)雜、耗時長，而且病毒基因整合的安全問題仍然存在。
不使用病毒的遞送方法更加快捷經(jīng)濟，不過在過去幾十年中，經(jīng)驗告訴我們，T細胞面對DNA轉(zhuǎn)染是很脆弱的，電穿孔誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致T細胞大量死亡。
如果搞清楚這個過程中T細胞到底受了什么傷，是否能讓它們變“堅強”？
研究者們將目光放到了環(huán)GMP-AMP合成酶（cGAS）身上，它是細胞質(zhì)中雙鏈DNA（dsDNA）的關(guān)鍵傳感器，cGAS的激活會通過STING蛋白激活干擾素依賴的免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致細胞死亡。
有趣的是，當(dāng)研究者們從人或小鼠T細胞中敲除cGAS或STING，發(fā)現(xiàn)這確實能夠阻止DNA誘導(dǎo)的細胞死亡。但是小鼠的STING抑制劑表現(xiàn)出明顯的邊際效應(yīng)，而人的STING抑制劑H151不能挽救細胞死亡。
STING抑制劑H151不能挽救細胞死亡
使用小干擾RNA（siRNA）倒是能夠預(yù)防DNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的STING激活，但是遞送siRNA又需要一次電穿孔，這是T細胞承受不了的。
那怎么辦呢？
研究者們的思路可以說是非常開闊。由于cGAS只在細胞質(zhì)中反應(yīng)，因此另外一種策略就是令轉(zhuǎn)染DNA快速進入細胞核、減少在細胞質(zhì)中的留存時間。
研究者們篩選比較了數(shù)百種電穿孔緩沖液和參數(shù)設(shè)置的組合，并找到了能夠最大程度上抑制cGAS-STING通路活性的一組。BO14緩沖液和EO138程序的組合比常用的商業(yè)設(shè)置P3緩沖液和EO115程序，能夠表現(xiàn)出更好的遞送效率。BO14-EO138的核定位效率為84.6%，P3-EO138則為69.5%。
BO14-EO138的核定位率更高
對緩沖液成分進行詳細分析后，研究者調(diào)整緩沖液比例后的B1mix能夠進一步提升敲入效率，同時保證T細胞活力。
原來，電穿孔緩沖液的滲透壓在介導(dǎo)cGAS與DNA結(jié)合上有重要作用，能夠影響下游2'3'-cGAMP的產(chǎn)生和STING激活。調(diào)整緩沖液滲透壓后，電穿孔制備CAR-T細胞數(shù)量比慢病毒遞送要多20倍，CAR-T的抗腫瘤殺傷性也更強。
新方法產(chǎn)生的CAR-T細胞絕對數(shù)量是對照的20倍
此外，值得一提的是，研究者們實驗中使用的DNA遞送量非常低，每次僅有1-3μg，是之前同類實驗的1/3-1/2，仍能夠產(chǎn)生足夠的CAR-T細胞，這無疑能夠大大簡化制造流程。
研究者還嘗試在治療相關(guān)的人類造血干細胞等其他細胞類型中進行了實驗，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)緩沖液滲透壓都能提升轉(zhuǎn)染效果。
改變緩沖液條件和程序設(shè)置就能這么大幅度地提升轉(zhuǎn)染效率，可以說是情理之中但意外之喜了~相信這些巧思能夠加速CAR-T邁向“更好更快更便宜”，趕快為大眾所用！
參考資料：
[1]An, J., Zhang, CP., Qiu, HY. et al. Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS–STING pathway. Nat. Biomed. Eng (2023). https:///10.1038/s41551-023-01073-7
本文作者丨代絲雨
