研發(fā)新人第一課丨了解芽孢桿菌

tssenpujgg 2023-05-26 發(fā)布于廣東

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作為微生態(tài)企業(yè)的研發(fā)人員，入職第一課是什么？作者認(rèn)為如果是應(yīng)屆畢業(yè)生或者跨行業(yè)的新人，入職研發(fā)后，一定是首先認(rèn)識芽孢桿菌，特別是模式種枯草芽孢桿菌。芽孢桿菌怎么會有這種魅力呢？

首先，芽孢桿菌產(chǎn)生休眠孢子，干燥、運輸、儲藏過程對其影響小，產(chǎn)業(yè)化可行性高。

其次，芽孢桿菌進(jìn)入適宜的環(huán)境，萌發(fā)后生長繁殖過程分泌多種酶類，促進(jìn)環(huán)境中有機(jī)質(zhì)的分解，是非常優(yōu)秀的分解者，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中水體凈化的首選。

再者，芽孢桿菌易培養(yǎng)、易觀察，分子生物學(xué)鑒定方法完善，應(yīng)用種類較細(xì)化（僅次于乳酸菌），飼料添加劑目錄中包含地衣、枯草、遲緩、短小、凝結(jié)、側(cè)孢芽孢桿菌和丁酸梭菌，其他常見芽孢桿菌還有簡單、蠟樣、堅強(qiáng)、貝萊斯、解淀粉、巨大芽孢桿菌等。

下面以常見模式種枯草芽孢桿菌為代表，全方位了解一下芽孢桿菌。

1. 相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)

常用檢測方法可參考《GBT 26428-2010 飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》。

2. 菌落形態(tài)

枯草芽孢桿菌菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黃色，用接種環(huán)易挑起。

3. 菌體形態(tài)

細(xì)菌桿狀，單生、對生或呈鏈狀。

4. 芽孢形態(tài)

芽孢橢圓形，中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大。

5. 活菌檢測

國標(biāo)方法關(guān)鍵點：培養(yǎng)基采用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、稀釋液采用0.85%滅菌生理鹽水；合適的梯度進(jìn)行80℃±1℃水浴處理10min，平板涂布，37℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。

根據(jù)不同菌株適應(yīng)生長環(huán)境不同，其他可選擇的培養(yǎng)基包括LB瓊脂等；根據(jù)芽孢桿菌營養(yǎng)體的耐熱情況不同，其他可選擇的水浴處理溫度包括75℃±1℃水浴處理20min等，此外對于芽孢成熟度≥99%的產(chǎn)品，為了提高檢測效率，可省去水浴一步。根據(jù)不同菌株生長速度，我們經(jīng)常使用的培養(yǎng)時間還有24h±2h。

6. 產(chǎn)酶檢測

原理：菌株生長產(chǎn)酶會分解培養(yǎng)基對應(yīng)的底物，形成透明圈，透明圈越大說明產(chǎn)酶能力越強(qiáng)，透明圈直徑/菌落直徑的校正圈菌比越大，表示該菌產(chǎn)該酶的能力越大。

(1) 蛋白酶

酪素培養(yǎng)基：干酪素10 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，pH 7.0，用蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。顯色液為酸性汞試劑：HgCl₂15 g，濃HCl 20 mL，加蒸餾水至100 mL。注意事項：干酪素不好溶解，可加部分NaOH調(diào)成堿性，磁力加熱攪拌待全溶解后再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0。

(2) 淀粉酶

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH 7.2，用蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。顯色液為盧戈氏碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水 300ml（注：先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀中，待碘全溶后，加足水分即可）。注意事項：①可溶性淀粉可先用少量涼水，攪拌后加入沸水中，會溶的比較好；②顯色劑顏色消失較快，需盡快測量。

(3) 脂肪酶

脂肪培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、瓊脂粉20g、水1L、pH7.5。脂肪酶解圈可直接觀測，無需顯色劑。

(4) 纖維素酶

纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉20g、酵母粉0.5g、磷酸氫二鈉2.5g、磷酸二氫鉀1.5g、蛋白胨2.5g、瓊脂粉20g、水1L、pH7.2。顯色液為剛果紅染液：剛果紅1g、水1L；洗脫液（1mol/L NaCl溶液）：NaCl 58.5g、水1L。在纖維素培養(yǎng)基上滴加剛果紅之后用1mol/L NaCl溶液沖洗酶解圈較清晰。

(5) 木聚糖酶

木聚糖培養(yǎng)基：木聚糖10g，蛋白胨5g，NH₄NO₃5g，MgSO₄ 0.3g，NaCl 5g，K₂HPO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 1g，酵母粉 0.3g，瓊脂20g，水1L，pH7.2；顯色劑為DNS：參照《GBT 23874-2009 飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》中DNS試劑配制方法。

(6) 幾丁質(zhì)酶

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：稱取 10 g 幾丁質(zhì)，加入濃 HCl，攪拌成糊狀后，放4℃冰箱溶脹，析出沉淀后倒去上清，補(bǔ)充純水后放置冰箱，重復(fù)此操作直至 pH≈7.0。在上述調(diào)過pH的幾丁質(zhì)膠體中加入以下物質(zhì)：K₂HPO₄ 0.7 g，KH₂PO₄ 0.3 g，MgSO₄0.5 g，F(xiàn)e₂(SO₄)₃0.01 g，酵母粉0.5 g，瓊脂20g，用純水定容至1 L，調(diào)pH至7.0；注意事項：幾丁質(zhì)膠體制備時間較長，需提前1周準(zhǔn)備；幾丁質(zhì)酶解圈可直接觀測。

7. 分子生物學(xué)鑒定

一般采用16S rDNA區(qū)段對芽孢桿菌進(jìn)行菌種鑒定，gyrB基因區(qū)段對芽孢桿菌進(jìn)行亞種鑒定，通過全基因組序列確定具體菌株。