1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品的采集

    樣品采自河南省洛陽(yáng)市河南科技大學(xué)校內(nèi)培育田10 cm深處土壤。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

    培養(yǎng)基配置和酶活測(cè)定所需試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    DNS試劑：參照文獻(xiàn)配置，常溫條件下靜置7 d，有效期為6個(gè)月。

    初篩固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL。

    種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g、蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1 000mL。

    發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、蛋白胨10 g，酵母粉5g、磷酸氫二鉀1g、NaCl1g、蒸餾水1 000mL。

    上述培養(yǎng)基配置結(jié)束，均121℃、0.1MPa滅菌20 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

    立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、JA-2003型電子精密天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、ReadMax-1000F型酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)、SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)、TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、SKY-2112B型恒溫?fù)u床(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

    取1g土壤樣品溶于9mL生理鹽水中，充分混勻，逐級(jí)梯度稀釋，稀釋后的樣品100μL均勻涂布于篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1~2 d直至菌落長(zhǎng)出。挑取生長(zhǎng)情況較好的菌株點(diǎn)接種于篩選固體培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出，使用Lugols碘液進(jìn)行染色，觀察透明圈大小，選取最佳產(chǎn)酶菌株。

1.2.2 菌株的鑒定

    形態(tài)學(xué)鑒定：觀察劃線平板上菌落的形態(tài)，通過革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體特征，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

    分子生物學(xué)鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增獲取16SrDNA片段，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST與Genebank中已知的其他相似16S rDNA片段序列進(jìn)行比對(duì)分析，通過軟件Mega X使用鄰接法(Neighbor-Joiningmethod )構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。

1.2.3 淀粉酶的酶學(xué)特性分析

1.2.3.1 粗酶液的制備

    將篩選出的產(chǎn)淀粉酶菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出，挑取單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基，37℃、180r/min過夜培養(yǎng)，將種子發(fā)酵液以1%接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)14~16 h，發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，所獲上清即為粗酶液。

1.2.3.2 酶活的測(cè)定

    繪制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用DNS法測(cè)定酶解后溶液中還原糖的含量，計(jì)算淀粉酶活力。

    淀粉酶活力定義：在一定pH值和溫度條件下，每分鐘水解1%淀粉溶液生成1 mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位，用U表示。

1.2.3.3最適反應(yīng)溫度

    在一定pH值條件下，將粗酶液與1%淀粉溶液混勻，分別在30、40、50、60、70、80℃條件下反應(yīng)，測(cè)定酶活力，確定該淀粉酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.3.4 最適反應(yīng)pH值

    在一定溫度條件下，分別測(cè)定粗酶液在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下的酶活力，確定該淀粉酶的最適反應(yīng)pH值。

1.2.3.5 熱穩(wěn)定性

將粗酶液分別在30、40、50、60、70、80℃條件下水浴30 min，測(cè)定剩余淀粉酶活力，分析該酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.3.6 pH值穩(wěn)定性

    將粗酶液分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下處理30 min，測(cè)定剩余淀粉酶活力，分析該酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.3.7 金屬離子對(duì)淀粉酶活力的影響

    將粗酶液與0.1mol/L的Na、K+、 Zn2+、Ca2+、Mn2+金屬離子鹽溶液按照1：1的比例混勻，使金屬離子鹽溶液的終濃度為0.05mol/L，測(cè)定此條件下的淀粉酶活力，以未加金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照，分析不同金屬離子對(duì)酶活力的影響。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)規(guī)律和產(chǎn)酶特點(diǎn)

    將種子發(fā)酵液按照1%的接種量接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)，每2h取樣1次，測(cè)定菌液在600nm處的吸光度以及菌液上清的淀粉酶活力，分析該菌的生長(zhǎng)規(guī)律和產(chǎn)酶特點(diǎn)。

2  結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

    通過樣品涂布初篩固體培養(yǎng)基，篩選出5株產(chǎn)淀粉酶菌株，產(chǎn)淀粉酶菌株的透明圈見圖1

圖1 產(chǎn)淀粉酶菌株的透明圈

    量取菌落直徑(d)和透明圈直徑(D)，計(jì)算二者比值(D/d)，產(chǎn)淀粉酶菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值見表1。由表1可知，選取比值最大的菌株XT進(jìn)行后續(xù)分析研究。

表1產(chǎn)淀粉酶菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值

2.2 菌株的鑒定

    菌株XT平板上菌落形態(tài)見圖2 (a)。由圖2(a)可知，菌株XT開始呈乳白色，后期發(fā)黃、半透明、圓形、表面微皺或內(nèi)凹。

    革蘭氏染色后鏡檢見圖2(b)。由圖2(b)可知，革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈桿狀，長(zhǎng)約2μm，芽孢中生或端生。

(a)平板上菌落形態(tài)       (b)革蘭氏染色后鏡檢

          圖2 菌株XT的形態(tài)學(xué)特征

    將菌株XT 16SrDNA序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，菌株XT系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3

圖3 菌株XT系統(tǒng)發(fā)育樹

    由圖3可知，該菌與巨大芽袍桿菌(Bacillus megaterium EU 918562.1)聚為一群，相似度達(dá)到99.93 %，結(jié)合形態(tài)學(xué)特性，將菌株XT鑒定為巨大芽袍桿菌(Bacillus megaterium)，命名為Bacillus megaterium XT(簡(jiǎn)稱XT)。

2.3 菌株XT所產(chǎn)淀粉酶的酶學(xué)特性分析

2.3.1 菌株XT最適反應(yīng)溫度(見圖4 (a))

    由圖4 (a)可知，該菌所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為50℃；在30和40℃條件下能夠發(fā)揮約90%的酶活；當(dāng)反應(yīng)溫度高于50℃，酶活力下降；在80℃條件下能夠發(fā)揮83%的酶活。研究表明，該酶在低溫和高溫條件下均能夠發(fā)揮一定的酶活力。

2.3.2 菌株XT最適反應(yīng)pH值(見圖4 (b))

    由圖4 (b)可知，該菌所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)pH值為7.0 ；在pH值6.0和8.0均能發(fā)揮相對(duì)較高的酶活;在pH值3.0時(shí)仍能夠發(fā)揮74%的酶活。研究表明，該酶在中性條件下能夠發(fā)揮較高的酶活力。

(a)菌株XT最適反應(yīng)溫度

           (b)菌株XT最適反應(yīng)pH值

圖4 淀粉酶的最適反應(yīng)條件

2.3.3 菌株XT熱穩(wěn)定性(見圖5 (a))

    由圖5 (a)可知，該菌在30和40℃能夠表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性；處理30 min后殘余酶活在80%以上；50℃以上處理30 min后，酶活下降50%以上；80℃處理30 min，殘余18%的酶活。研究表明，菌株XT在高溫條件下處理30 min后還能夠發(fā)揮少量酶活力。

2.3.4 菌株XT的pH值穩(wěn)定性(見圖5 (b))

    由圖5 (b)可知，該菌在中性條件下穩(wěn)定性較好，酸性條件下穩(wěn)定性較差;pH值8.0處理30 min，殘余80%左右的酶活;pH值6.0處理30 min，殘余63%的酶活。

研究表明，該酶可以在中性和弱堿性條件下應(yīng)用，但不適用于酸性條件，可以在動(dòng)物腸道中充分發(fā)揮酶解作用，幫助動(dòng)物消化吸收營(yíng)養(yǎng)，而酶解后生成的小分子化合物，也能夠發(fā)揮一定的益生元作用，從而穩(wěn)固腸道有益微生態(tài)菌群。

(a)菌株XT熱穩(wěn)定性   

(b)菌株XT的pH值穩(wěn)定性

    圖5 淀粉酶的穩(wěn)定性

2.3.5 金屬離子對(duì)淀粉酶活力的影響(見圖6)

    不同金屬離子對(duì)酶活力主要有兩方面的影響：激活作用和抑制作用。由圖6可知，菌株XT所產(chǎn)淀粉酶的活力可以被Na+， K+和Ca2+激活，而Mn2+和Zn2+對(duì)酶活力具有抑制作用。

注：數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05 )

      圖6  金屬離子對(duì)淀粉酶活力的影響

2.3.6 菌株XT的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶規(guī)律(見圖7)

圖7  菌株XT的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶規(guī)律

    由圖7可知，該菌在0~4 h生長(zhǎng)較緩慢，此時(shí)期為遲緩期；4~14 h期間，菌株迅速生長(zhǎng)繁殖，菌體密度增長(zhǎng)較快，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，此時(shí)期為對(duì)數(shù)期；14~22h期間，菌體數(shù)量較穩(wěn)定，并呈現(xiàn)微弱的下降趨勢(shì)，此時(shí)期為穩(wěn)定期，逐步進(jìn)入衰亡期；22~24 h可見菌體數(shù)目下降，大量菌體生長(zhǎng)代謝所需營(yíng)養(yǎng)不能得到充足的供應(yīng)，代謝過程中的各種產(chǎn)物對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，菌體量將會(huì)大幅度減少。

    由圖7的產(chǎn)酶曲線可知，菌株XT的產(chǎn)酶稍落后于菌體的增殖。在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期開始2h后，酶活開始逐步提高，說明此時(shí)菌體開始大量分泌淀粉酶；當(dāng)菌體生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期后，上清中淀粉酶活力達(dá)到最高值6.18U/mL；在穩(wěn)定期后期，酶活開始下降，說明該菌株所分泌的淀粉酶的活性一方面受到菌體活力的影響，另一方面受到菌體代謝產(chǎn)物的影響。因此，應(yīng)于穩(wěn)定期對(duì)該菌所產(chǎn)淀粉酶進(jìn)行收獲。

3 討論

    土壤中含有一定量源自動(dòng)植物殘骸、風(fēng)化巖石的有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)以及各種降解利用該類物質(zhì)的微生物。因此，土壤是常用的篩菌樣品。飼料中淀粉的高效利用能夠起到節(jié)約能量飼料和降低飼料成本的作用，酶解淀粉能夠使腸道食糜黏度降低，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)還能夠發(fā)揮益生元的作用，維護(hù)腸道以及動(dòng)物體健康。因此，淀粉酶在飼料業(yè)和畜牧業(yè)中具有非常重要的價(jià)值。

    淀粉酶在畜牧業(yè)中能夠改善單胃動(dòng)物對(duì)飼料的利用率。淀粉酶添加在斷奶仔豬日糧中，能夠改善動(dòng)物消化功能并提高機(jī)體免疫力。淀粉酶能夠通過改善青貯飼料的品質(zhì)提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶能夠提高青貯發(fā)酵產(chǎn)物的水溶性碳水化合物、乳酸和乙酸的產(chǎn)量，從而改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。

    本研究中，篩選到的產(chǎn)酶菌為巨大芽孢桿菌，該菌是1種具有良好抗逆性的益生菌。芽孢桿菌具有較好的產(chǎn)酶、產(chǎn)活性肽類的特性。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌發(fā)酵飼料還能夠改善水產(chǎn)動(dòng)物的體色，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該菌所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)條件為50℃、pH值7.0，雖然與大多數(shù)淀粉酶類似，但是該菌在弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)包被過胃后能夠在腸道弱堿性環(huán)境中發(fā)揮作用。在產(chǎn)酶功能菌的篩選過程中，除了要分析所產(chǎn)酶的特性外，對(duì)菌株本身的生長(zhǎng)特點(diǎn)和產(chǎn)酶特點(diǎn)的研究也很重要。通過對(duì)菌株生長(zhǎng)酶特點(diǎn)進(jìn)行分析，可以掌握發(fā)酵生產(chǎn)過程中的最佳收獲時(shí)間點(diǎn)，從而降低成本。本研究結(jié)果表明，在生長(zhǎng)穩(wěn)定期淀粉酶的活力較高，因此可在穩(wěn)定期對(duì)淀粉酶進(jìn)行收獲。不同的培養(yǎng)條件也會(huì)影響菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。有研究對(duì)篩選到的蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h所產(chǎn)淀粉酶活力最高。也有研究通過響應(yīng)面法對(duì)貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶進(jìn)優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間4d時(shí)產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。

4 結(jié)論

    本研究表明，巨大芽孢桿菌最適反應(yīng)條件為50℃、pH值7.0，在中低溫條件下以及中性和弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，Na⁺、K⁺和Ca²⁺對(duì)酶活力具有激活作用，而Mn²⁺和Zn²⁺對(duì)酶活力具有抑制作用，該菌在生長(zhǎng)穩(wěn)定期，上清酶活最高。因此，可在14~16 h對(duì)淀粉酶進(jìn)行收獲。