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一、微生物酶的分類、作用機(jī)理及來源 1.1淀粉酶。淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。 α-淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，能夠切開淀粉鏈內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。 β-淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4-糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。 糖化酶又稱淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非還原性末端，以葡萄糖為單位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖。此酶作用于支鏈淀粉后的產(chǎn)物有葡萄糖和帶有α-1，6-糖苷鍵的寡糖；作用于直鏈淀粉后的產(chǎn)物幾乎全部是葡萄糖。此酶產(chǎn)生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、擬內(nèi)孢霉、紅曲霉。 異淀粉酶又稱淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝鏈淀粉分子分枝點處的α-1，6-糖苷鍵，將枝鏈淀粉的整個側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。此酶產(chǎn)生菌主要是嫌氣桿菌、芽孢桿菌及某些假單孢桿菌等細(xì)菌。 1.2蛋白酶。蛋白酶系催化分解蛋白質(zhì)肽鍵的一群酶的總稱，它作用于蛋白質(zhì)，將其分解為蛋白胨、多肽及游離氨基酸。此酶種類繁多，廣泛存在于所有生物體內(nèi)，按其來源可分為植物蛋白酶、動物蛋白酶、微生物蛋白酶(又可分為細(xì)菌蛋白酶、放線菌蛋白酶、霉菌蛋白酶等)；按其作用形式可分為肽鏈內(nèi)切酶、肽鏈外切酶；按所產(chǎn)蛋白酶性能分為酸性蛋白酶、霉菌蛋白酶酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶。 酸性蛋白酶(最適pH=2～5)產(chǎn)生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、似青霉、青霉、血紅色螺孔菌等的某些種；中性蛋白酶(最適pH=7～8)產(chǎn)生菌主要是枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、微白色鏈霉菌、耐熱性解蛋白質(zhì)桿菌等；堿性蛋白酶(最適pH=9～11)主要產(chǎn)生菌為枯草桿菌、臘狀芽孢桿菌、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、鐮刀菌等。 微生物產(chǎn)生的蛋白酶大多是幾種酶的混合物，只不過是主次之分而已。另外，改變培養(yǎng)基的組成或者菌種經(jīng)誘變，可以改變產(chǎn)酶的性能，例如，據(jù)報道，黑曲霉的變株可生產(chǎn)堿性蛋白酶，米曲霉的變株可生產(chǎn)酸性蛋白酶。 1.3纖維素酶。纖維素酶是降解纖維素β-1，4-葡萄糖苷鍵的一類酶的總稱，因此纖維素酶又有纖維素酶復(fù)合物之稱。通常認(rèn)為主要包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶。C1酶主要作用天然纖維素，將其轉(zhuǎn)變成水合非結(jié)晶纖維素；CX酶又可分為CX1酶和CX2酶，CX1酶是內(nèi)斷型纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于β-1，4-糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二糖，CX2酶為外斷型纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子的非還原性末端作用于β-葡萄糖苷酶又稱纖維二糖酶，它作用于纖維二糖，生成葡萄糖。這些酶協(xié)同作用可將纖維素徹底降解為還原糖-葡萄糖。纖維素酶可破解富含纖維的細(xì)胞壁，使其包含的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來并加以利用，同時又可將纖維降解為可被畜禽機(jī)體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率。產(chǎn)生纖維素酶的微生物研究較多的是真菌，對細(xì)菌和放線菌研究很少。當(dāng)前用來生產(chǎn)纖維素酶的微生物主要是木菌、黑曲霉、青霉和根霉，此外，漆斑霉、反芻動物瘤胃菌、嗜纖維菌、產(chǎn)黃纖維單孢菌、側(cè)孢菌、粘細(xì)菌、梭狀芽孢桿菌等也能產(chǎn)生纖維素酶。 由于纖維素酶難以提純，實際應(yīng)用的纖維素酶(尤其在飼料工業(yè)中)一般還含有半纖維素酶和其他相關(guān)的酶如果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等。 1.4半纖維素酶。半纖維素酶是分解半纖維素(包括各種降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。這些酶的主要作用就是降解畜禽消化道內(nèi)的非淀粉多糖，降低腸道內(nèi)容物的粘性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，減少畜禽下痢，從而促進(jìn)畜禽生長和提高飼料利用率。半纖維素酶主要由各種曲霉、根霉、木霉發(fā)酵產(chǎn)生。在飼料工業(yè)中應(yīng)用較多的是β-葡聚糖酶，它主要由曲霉、木霉和桿菌屬類微生物產(chǎn)生，它應(yīng)用于以大麥替工玉米的日糧中，借以降低飼養(yǎng)成本，而達(dá)到與玉米相同的飼喂效果。 1.5果膠酶。果膠酶是分解果膠的酶的通稱，也是一個多酶復(fù)合物，它通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶三種酶。這三種酶的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下，被轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠；果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基因，生成果膠酶；果膠酸酶切斷果膠酸中的α-1，4-糖苷鍵，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸進(jìn)入糖代謝途徑被分解放出能量。工業(yè)生產(chǎn)果膠酶的菌種主要是霉菌，常用菌種有文氏曲霉、蘋果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等，此外，木質(zhì)殼霉、芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、葡萄孢霉、鐮刀霉也能產(chǎn)生果膠酶。飼料工業(yè)中果膠酶多用于提高青貯飼料的品質(zhì)。 1.6脂肪酶。脂肪酶作用于脂肪中的酯鍵，將脂肪分解成脂肪酸和甘油。生產(chǎn)脂肪酶的微生物主要有假絲酵母、園酵母、黑曲霉、根霉、白腐核菌、白地霉、青霉、毛霉、鐮刀霉及假單孢菌、無色桿菌、葡萄球菌等。 1.7植酸酶。植酸酶是降解飼料中植酸及其鹽的酶。飼料中玉米、大豆、豆餅及谷物中的磷，大部分存在于植酸和植酸鹽中，這種形式的磷不能或很少被單胃動物利用，同時，植酸和植酸鹽還是影響動物體內(nèi)微量元素消化利用的螯合劑，嚴(yán)重影響二價陽離子礦物元素的利用，最終導(dǎo)致飼料成本增加、磷源浪費(fèi)和環(huán)境污染。在飼料中添加植酸酶，可將植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸鹽，供動物吸收利用，從而提高磷的利用率和骨骼礦化程度，減少飼料中磷源的添加和糞便中磷的排出，減少環(huán)境污染。產(chǎn)生植酸酶的微生物主要是酵母菌、霉菌和細(xì)菌。 二、微生物酶的生產(chǎn) 2.1培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不同，微生物的比生長速率和酶形成能力也不同，因而在培養(yǎng)基中提供適當(dāng)而豐富的營養(yǎng)物，是菌體生長和酶大量產(chǎn)生的重要前提。酶制劑生產(chǎn)中所用原料主要包括碳源(包括能迅速利用的單糖、雙糖和緩慢利用的淀粉、纖維素等多糖)、氮源(包括豆餅粉、花生餅粕、魚粉、蠶蛹粉、酵母粉、玉米漿等有機(jī)氮源和銨鹽、硝酸鹽等無機(jī)氮源)、無機(jī)鹽和誘導(dǎo)物，固體發(fā)酵往往還要加入一定量利用通風(fēng)的載體如稻殼、玉米皮等。實踐證明，培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例即碳氮比(通常用C/N表示)就直接影響菌體的生長、繁殖和酶的生成。當(dāng)C/N比值過小時，即培養(yǎng)基中氮源過多，造成微生物生長過盛，而碳源供應(yīng)不足，容易引起菌體衰老和自溶，造成氮源浪費(fèi)和酶產(chǎn)時下降；如果C/N比值過高，即氮源不足，微生物生長過慢，一方面容易引起雜菌感染，另一方面由于沒有足夠量的微生物來產(chǎn)酶，也會造成碳源糧費(fèi)和酶產(chǎn)量下降。因此，應(yīng)根據(jù)各種微生物的特性，恰當(dāng)?shù)剡x擇適宜的C/N比值，是提高酶產(chǎn)量的重要措施。各種無機(jī)鹽類和微量元素如磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、鋅、錳等，是微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要成分或酶的組成成分或維持酶的活性，能促進(jìn)微生物生長、發(fā)育、刺激酶的生成，培養(yǎng)基中不可或缺。對于含復(fù)雜成分的培養(yǎng)基來說，原料和水中往往已含有足夠量的無機(jī)元素，一般不需另外添加。但不同菌種的需要量不同，應(yīng)通過實驗來研究確定。飼料工業(yè)所用微生物酶大都屬于誘導(dǎo)酶類，因此向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物就會增加胞外酶的產(chǎn)量。如加入槐糖能誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的生成，木糖誘導(dǎo)半纖維素酶的生成。但誘導(dǎo)物價格往往比較昂貴，實際生產(chǎn)中一般加入廉價的含有誘導(dǎo)物的原料來代替，如槐豆莢等某些植物的種籽皮中含有槐糖，玉米芯富含木取糖，培養(yǎng)過程中可陸續(xù)被水解產(chǎn)生槐糖、木糖。 2.2產(chǎn)酶微生物的要求。生產(chǎn)酶制劑所用菌種要能利用比較廉價和簡單和原料，且食性越廣越好，在不需添加誘導(dǎo)劑的條件下容易生長，且生長迅速；產(chǎn)生的酶容易分離純化和濃縮，酶活性要高，穩(wěn)定性要好，活性譜要寬；產(chǎn)酶微生物應(yīng)具有穩(wěn)定的生理特性，而且不形成有毒或致免疫的代謝物。特別要說明的是，產(chǎn)酶菌種除公認(rèn)是安全菌株外，都要做毒性實驗。 2.3發(fā)酵生產(chǎn)。微生物酶的生產(chǎn)，目前主要采用液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種方式。與其他培養(yǎng)方式相比，液體深層發(fā)酵具有如下優(yōu)點：1)液體懸浮狀態(tài)是許多微生物的最適生長環(huán)境；2)在液態(tài)環(huán)境中，菌體、底物、產(chǎn)物(包括熱)易于擴(kuò)散，使發(fā)酵在均質(zhì)或擬均質(zhì)條件下進(jìn)行，便于檢測、控制，易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模；3)液體輸送方便，易于機(jī)械化操作；4)產(chǎn)品易于提取精制。與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵具有如下缺點：1)生產(chǎn)工藝主要限于耐低水活性的菌中；2)微生物生長速度較慢，產(chǎn)物有限；3)大規(guī)模操作時，產(chǎn)生的代謝熱較難散去，生產(chǎn)過程中固態(tài)發(fā)酵參數(shù)難以準(zhǔn)確測定，難以實現(xiàn)操作的機(jī)械化及控制的自動化；4)生化反應(yīng)器的設(shè)計還不完善，傳統(tǒng)的發(fā)酵方式易染雜菌。但是，固體發(fā)酵也具有很多液體發(fā)酵所不具備的優(yōu)點，主要表現(xiàn)為：1)培養(yǎng)基簡單，多為便宜的天然基質(zhì)；2)基質(zhì)的低含水量可大大減少生化反應(yīng)器的體積，不需要廢水處理，較少環(huán)境污染，常不需要嚴(yán)格的無菌操作，后處理加工方便；3)不一定連續(xù)通風(fēng)，一般可由間歇通風(fēng)或氣體擴(kuò)散完成；4)產(chǎn)物的產(chǎn)率可較高；5)設(shè)備簡單，投資小，能耗低。由于飼料工業(yè)附加值低，飼料用酶無需精制，因此，采用固態(tài)發(fā)酵更為合適。國內(nèi)復(fù)合酶制劑的生產(chǎn)一般采用固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵主要用于植酸酶的生產(chǎn)或生產(chǎn)單酶制劑用于復(fù)配合酶制劑。 微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)是由微生物的生化活動和環(huán)境條件相互作用完成的。在發(fā)酵生產(chǎn)中，只有環(huán)境條件能夠被直接調(diào)節(jié)和控制。除培養(yǎng)基成分及其濃度外，接種量、溫度、pH、溶解氧等環(huán)境變量也都能影響微生物代謝活動，在固體發(fā)酵中，發(fā)酵空間的空氣濕度及物料含水量也嚴(yán)重影響菌種的代謝活動和產(chǎn)酶量。菌種不同，生產(chǎn)酶制劑所需工藝條件也不同，其最佳工藝參數(shù)必須通過實驗來確定。只有為培養(yǎng)物提供一個最適的環(huán)境，菌體的代謝活動才能得到最充分的表達(dá)，酶產(chǎn)量才高。 2.4酶的提取。在發(fā)酵基質(zhì)中，酶都與大量的其他物質(zhì)共同存在，而且酶的含量比其他物質(zhì)要少得多，因此工業(yè)用酶需從大量的其他物質(zhì)中將酶分離出來。但飼料用酶無需純酶，且發(fā)酵所用基質(zhì)及菌體在生長過程中所產(chǎn)生的氨基酸、維生素、核苷酸、促生長因子等成分對畜禽生長都是有利的，因此飼料用酶無需精制，只要將發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行濃縮(對液體發(fā)酵來講)、干燥獲得粗酶制品即可。 2.5酶的保藏。酶是生物活性物質(zhì)，酸、堿、有機(jī)溶劑、重金屬、表面活性劑、高溫、紫外線等一些理化因素易引起酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成酶的失活，保藏時應(yīng)注意避免這些不利因素。對于酶的保藏，要保持酶長期不失活，關(guān)鍵要控制好水分和溫度兩個條件。一般含水量高時酶易失活，含水量超過10 %，在室溫或低溫下均易失活；含水量降至5 %時，在室溫或低溫下較穩(wěn)定，溫度越高，越易失活。因此最好在低溫下保存酶制品，特別是酶制品含水分較高時，更宜低溫保存。日光照射有時也引起某些酶的失活，因此酶應(yīng)避免日光直射。一些重金屬離子(如銅、鐵、鉛、汞、銀等)會抑制酶的活力，甚至?xí)姑甘Щ?，?yīng)盡量避免與這些物質(zhì)接觸。酶的底物和某些物質(zhì)具有保存酶的作用，因此酶貯存時應(yīng)根據(jù)酶的不同特性添加酶的穩(wěn)定劑或進(jìn)行包被處理，以使酶長期保存不失活。 三、微生物酶的應(yīng)用 3.1酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛，從最初就用于仔豬、肉雞逐步推廣到生長豬、蛋禽、珍禽及草食動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，從東南沿海逐漸延伸到西北內(nèi)陸。最初人們只是使用單一酶制劑，由于單一酶制劑成分單一，而飼料原料成分復(fù)雜，各地飼料原料、飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)環(huán)境各異，因而使用效果不太理想。現(xiàn)在，除了植酸酶還可作用單項酶制劑應(yīng)用外，人們普遍使用含有多種酶類的復(fù)合酶制劑。由于各酶類之間相互協(xié)相互促進(jìn)，因而復(fù)合酶制劑的使用效果較好。復(fù)合酶制劑，有的是采用多種單一酶制劑復(fù)配而成，有的是有用多株菌種協(xié)同發(fā)酵而成。由于多株菌種協(xié)同發(fā)酵的酶制劑除含酶制劑成分較多外，菌種生長過程中還產(chǎn)生一些氨基酸、維生素、促生長因子、核苷酸等成分。因此使用效果比復(fù)配的酶制劑要好。 3.2復(fù)合酶制劑的設(shè)計，應(yīng)根據(jù)各種酶的特性、活性及飼料原料、飼養(yǎng)對象的不同而不同。有些酶制劑，體外測定活性挺高，作用效果也不錯，但應(yīng)用效果并不理想。主要原因是體外測定試驗時其作用條件與畜禽消化道內(nèi)的生理條件相差很大，致使高活性在畜禽體內(nèi)表現(xiàn)不出來。如有些淀粉酶的最適作用溫度為60℃，在畜禽體內(nèi)(40 ℃在右)活性就達(dá)不到這么高；有些酶只有堿性條件下才發(fā)揮作用，畜禽體內(nèi)的酸性環(huán)境就可使該酶失活。因此，選擇酶制劑時，最好使酶的最適作用條件與畜禽消化道條件相一致，以使酶最大限度地發(fā)揮其作用。 3.3復(fù)合酶制劑所含酶的種類也并非越多越好，應(yīng)根據(jù)飼料原料及飼喂對象而設(shè)計。如β-葡聚糖酶，國外主要用于添加于大麥日糧中以降解β-葡聚糖，而我國飼料主要以玉米-豆粕型日糧為主，添加β-葡聚糖酶就沒有什么效果；果膠酶主要用于降解果膠，飼料中如無青貯飼料，添加該酶也沒有明顯效果。不同的飼喂對象、甚至同一飼喂對象的不同生長階段，體內(nèi)所需酶類也不一樣，因此添加的外源酶制劑也不應(yīng)相同，以免造成酶制劑的浪費(fèi)或添加量不足，影響飼養(yǎng)效益。 四、現(xiàn)階段存在的問題 4.1微生物酶的生產(chǎn)屬于微生物發(fā)酵的范疇，而應(yīng)用屬于畜牧業(yè)的范疇，由于專業(yè)間的差異，給酶制劑的管理造成一定困難。至今國內(nèi)尚無飼料用酶制劑統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各生產(chǎn)單位為了使用方便各自利益，自己制訂活力單位、檢測標(biāo)準(zhǔn)，給酶制劑質(zhì)量評定、飼喂應(yīng)用帶來一定的困難，同時也不利于生產(chǎn)工藝的進(jìn)一步優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)量的提高。 4.2飼料用酶制劑發(fā)酵國內(nèi)大多采用固體發(fā)酵，由于固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝存在的一些缺陷目前無法克服，造成產(chǎn)品質(zhì)量不如液體發(fā)酵穩(wěn)定，在生產(chǎn)中(尤其是一些小廠家)有時帶入雜菌，給應(yīng)用帶來一定的不利因素。 4.3飼料加工過程(主要是制粒)中的高溫、配合飼料中的重金屬離子、動物體內(nèi)環(huán)境等可導(dǎo)致酶制劑失活，因此酶的穩(wěn)定性是酶應(yīng)用中的一大問題。應(yīng)用中應(yīng)注意對酶制劑進(jìn)行穩(wěn)定化處理。此外，篩選優(yōu)良菌種或通過基因工程技術(shù)對菌種實行改造，使之產(chǎn)生的酶能耐高溫、有較寬的pH作用范圍等抗不良外界條件的性能，也是可供選擇的一種好方法。(蘇柯漢供稿) |
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