清香大曲及酒醅中地衣芽孢桿菌的分離鑒定 芽孢桿菌是大曲中常見(jiàn)微生物，也是重要類群之一。地衣芽孢桿菌一直以來(lái)被認(rèn)為是醬香型白酒高溫大曲中特有的微生物，就我們研究發(fā)現(xiàn)，在牛欄山酒廠生產(chǎn)用的多種清香大曲、出池酒醅中同樣存在地衣芽孢桿菌，對(duì)分離出23株芽孢桿菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定出12株地衣芽孢桿菌，鑒定結(jié)果與中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院分子鑒定結(jié)果一致。本文主要介紹地衣芽孢桿菌的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)方法，為地衣芽孢桿菌的鑒定提供比較完備的一套方法。

1 地衣芽孢桿菌的分離

1.1材料

牛欄山酒廠生產(chǎn)用清香大曲、釀酒車間酒醅

1.2分離用培養(yǎng)基

肉汁培養(yǎng)基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，pH 7.0-7.2，121℃，滅菌30min。

1.3分離方法

取大曲干粉或酒醅0.5g，加入帶有玻璃珠的無(wú)菌水三角瓶中，搖床培養(yǎng)30min，60℃水浴30min，然后用接種環(huán)蘸取，在肉汁培養(yǎng)基平板上劃線分離。挑取單菌落繼續(xù)劃線分離，直到得到單菌落純菌株為止。

2 地衣芽孢桿菌生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述分離培養(yǎng)基和分離方法，共計(jì)分離得到芽孢桿菌23株，編號(hào)分別為1＃、2＃、3＃、4＃……22＃、23＃，接下來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)這些菌株進(jìn)行篩選和鑒定。地衣芽孢桿菌鑒定參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠，蔡妙英等編著）的方法，有所改進(jìn)，以下為具體的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定方法。

2.1檸檬酸鹽與丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)

某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為唯一碳源，并利用磷酸銨作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。培養(yǎng)基配方：檸檬酸鈉（或丙酸鈉）0.2％，NaC1 0.5％，MgSO4?7H2O 0.01％，(NH4)2HPO4 0.1％，K2HPO4?3H2O 0.1％，1%溴百里酚藍(lán)水溶液10ml，瓊脂2％。以上成分除指示劑外其余加熱溶解，調(diào)節(jié)pH＝6.8-7.0，并加入指示劑，使培養(yǎng)基呈草綠色，分裝試管，滅菌后擺斜面。

取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng)3-7d，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽(yáng)性反應(yīng)，不變者為陰性。只有地衣芽孢桿菌可以利用丙酸鈉，為陽(yáng)性反應(yīng)，而其他芽孢桿菌均不能利用丙酸鈉，為陰性反應(yīng)，但很多種芽孢桿菌都可以利用檸檬酸鈉。

2.2產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)

2.2.1過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

過(guò)氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過(guò)氧化氫分解水和氧。將芽孢桿菌接種于肉汁培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18-24h。取干凈的載玻片，在上面滴1滴3-5％的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)18-24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，無(wú)氣泡者為陰性。也可將過(guò)氧化氫溶液直接加到菌種斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。

2.2.2淀粉酶實(shí)驗(yàn)

某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為無(wú)色糊精等小分子，或進(jìn)一步水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不變藍(lán)色。

培養(yǎng)基：在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2％的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121℃ 20min滅菌備用。盧戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。

將滅菌后放入培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，倒成平板，凝固后，取18-24h的純培養(yǎng)物點(diǎn)于平板上，每皿可點(diǎn)種3-5個(gè)菌株，適溫培養(yǎng)2-4d，形成菌落后，在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板成藍(lán)色。如果菌落周圍有無(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉已經(jīng)被水解，實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，否則為陰性。透明圈的大小一般說(shuō)明水解淀粉的能力。

2.2.3 纖維素酶實(shí)驗(yàn)

采用剛果紅染色法，如果有剛果紅存在，剛果紅可以與纖維素結(jié)合成紅色螯合物，培養(yǎng)基顏色為紅色。如果培養(yǎng)基中有能夠產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，將纖維素分解，不能形成螯合物，在菌落周圍形成透明圈。這樣可以鑒定產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌。 培養(yǎng)基的配制：CMC-Na 5-10g，酵母膏 1g，KH2PO4 0.25g，瓊脂15g，將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容到1000ml，加入5ml 10mg/ml的剛果紅溶液，121℃，滅菌20min，冷卻倒平板，凝固后待用。取18-24h的培養(yǎng)物點(diǎn)于平板上，每皿可點(diǎn)種3-5個(gè)菌株，適溫培養(yǎng)2-4d，形成菌落后，觀察產(chǎn)生透明圈情況，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈，否則為陰性。

2.2.4明膠液化實(shí)驗(yàn)

明膠是一種動(dòng)物性蛋白，明膠的水解是由于有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。明膠培養(yǎng)基本身低于20℃凝固，高于24℃則自行液化。明膠分解后，其分子變小，雖在低于20℃的溫度下也不再凝固。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH7.2-7.4，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4-5cm，115℃ 20min滅菌。

挑取18-24h培養(yǎng)物，以穿刺法接種于試管中央，于20-22℃培養(yǎng)。每天觀察結(jié)果，液化為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.3需厭氧實(shí)驗(yàn)

在培養(yǎng)基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛合次硫酸鈉等，以除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧情況下生長(zhǎng)。培養(yǎng)基：酪素水解物20g，NaC1 5g，巰基醋酸鈉HS?CH2COONa 2g，甲醛合次硫酸鈉HOCH2?SO2Na 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH 7.2，分裝試管121℃滅菌20min，培養(yǎng)基不擺斜面。

用1環(huán)肉湯菌液，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，必須穿刺到管底。30℃培養(yǎng)3-7d觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長(zhǎng)者為好氧菌，如沿著穿刺線生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌。

2.4乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V.P實(shí)驗(yàn))

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V.P陽(yáng)性反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋[FS:PAGE]白胨5g，葡萄糖5g，NaC1 5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)pH7.0-7.2，分裝試管，每管約裝4-5ml，115℃滅菌20min。試劑：40％NaOH（或KOH），肌酸。

接種于上述培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)4-6d。如為陰性，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40％NaOH相混合，加少量（約0.5-1.0mg）肌酸，充分振蕩2-5min，如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色即為陽(yáng)性。有時(shí)需放置更長(zhǎng)時(shí)間或在熱水中稍加熱，以加速反應(yīng)進(jìn)行。

2.5酪素水解實(shí)驗(yàn)

牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50ml蒸餾水中（或用50ml脫脂牛奶），取1.5g瓊脂溶于50ml蒸餾水中，將兩溶液分開(kāi)滅菌。待冷至45-50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過(guò)夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接3-5個(gè)株菌。適溫培養(yǎng)3-5d，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。

2.6酪氨酸水解實(shí)驗(yàn)

有些細(xì)菌具有酪氨酸酶，能使含酚類的化合物如酪氨酸、酚等氧化成醌，再經(jīng)脫水、聚合等一系列反應(yīng)，最后形成黑色沉淀物質(zhì)。培養(yǎng)基：采用肉湯蛋白胨培養(yǎng)基加0.1％L-酪氨酸，調(diào)節(jié)pH為7.0，分裝121℃滅菌20min后擺成斜面。接種后培養(yǎng)3-7d，觀察斜面有黑色素者為陽(yáng)性反應(yīng)。

2.7酸性培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH 5.7，115℃滅菌20min。取菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種普通肉湯液（pH 7.0）作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1-3d內(nèi)觀察生長(zhǎng)情況。該培養(yǎng)液要求十分澄清，pH必須準(zhǔn)確，用pH計(jì)調(diào)測(cè)。

2.8耐鹽性實(shí)驗(yàn)

耐鹽性實(shí)驗(yàn)是觀察滲透壓對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的NaCl，接種后觀察其生長(zhǎng)與否，以判斷其耐鹽性。

根據(jù)鑒定需要，以肉湯培養(yǎng)液配成不同濃度NaCl溶液，如2％、5％、7％、10％等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液接種，適溫培養(yǎng)3-7d，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長(zhǎng)情況。

2.9生長(zhǎng)溫度實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌生長(zhǎng)的最高、最適、最低溫度，常常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度，要求培養(yǎng)液十分澄清（如營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基），并采用液體菌種直接接種，放置于恒溫水浴培養(yǎng)。在指定溫度下培養(yǎng)2-5d，觀察生長(zhǎng)情況。若在接近0℃的低溫培養(yǎng)，則觀察時(shí)間可延長(zhǎng)7-10d或更長(zhǎng)。培養(yǎng)5d能生長(zhǎng)者按生長(zhǎng)計(jì)算，否則按不生長(zhǎng)計(jì)算，可疑者需重新進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.10產(chǎn)醬香實(shí)驗(yàn)

地衣芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)中的一個(gè)重要作用就是產(chǎn)生醬香物質(zhì)，這與其產(chǎn)生蛋白酶類有關(guān)，蛋白酶將蛋白質(zhì)分解成肽類和氨基酸，經(jīng)過(guò)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生醬香物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用三種培養(yǎng)基鑒定地衣芽孢桿菌是否產(chǎn)生醬香物質(zhì)。

甘氨酸培養(yǎng)基：甘氨酸5g，葡萄糖10g，NaCl 3g，蒸餾水1000ml，pH 6-7，分裝50ml到100ml三角瓶中，121℃滅菌20min。營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH 7.0-7.4，分裝50ml到100ml三角瓶中，121℃滅菌30min。以上兩種培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基，取培養(yǎng)18-24h菌種接入到液體培養(yǎng)基中，搖床37℃培養(yǎng)48-60h，取出，鑒定是否產(chǎn)生醬香物質(zhì)。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮1000g，NaOH 6g，蒸餾水600ml，分裝到500ml三角瓶中，121℃滅菌40min。接入液體培養(yǎng)菌種10％，恒溫箱培養(yǎng)3-5d，取出，鑒定是否產(chǎn)生醬香物質(zhì)。

2.11糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)主要是看該種糖能不能被微生物利用，如果能夠利用則會(huì)發(fā)酵產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中的指示劑會(huì)由紫色變黃色，同時(shí)可能伴有氣泡產(chǎn)生，如果發(fā)酵產(chǎn)氣則試管中倒扣的杜氏管中培養(yǎng)基會(huì)被排出，里面充滿氣體。本實(shí)驗(yàn)中糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖等。培養(yǎng)基配方為：(NH4)2HPO4 1g，MgSO4?7H2O 0.2[FS:PAGE]g，KC1 0.2g，酵母膏0.2g，糖或醇類10g，蒸餾水1000ml，0.04％溴甲酚紫乙醇溶液20ml，調(diào)節(jié)pH 7.0-7.2，分裝試管，每管裝10ml培養(yǎng)基，試管內(nèi)放有杜氏發(fā)酵管，115℃滅菌20min，排凈杜氏管中的空氣。

以18-24h的幼齡菌種，接種一環(huán)到上述培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)3-5d，觀察指示劑是否由紫色變黃，杜氏管中是否有空氣。

3生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果（具體結(jié)果見(jiàn)附表1，2，3）

3.1檸檬酸鹽與丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

23個(gè)菌株均可以利用檸檬酸鹽，這也與多種芽孢桿菌都可以利用檸檬酸鈉的特征符合。只有地衣芽孢桿菌可以利用丙酸鹽，2＃、5＃、8＃、10＃、13＃、14＃、16＃、17＃、18＃、19＃、21＃、22＃這12株均可以利用丙酸鹽，可以初步認(rèn)為這12株為地衣芽孢桿菌，還需要其他的生理生化實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

3.2淀粉酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)的23個(gè)菌株中，11＃菌株不能水解淀粉，未產(chǎn)生透明圈。3＃、7＃、9＃三個(gè)菌株產(chǎn)生的透明圈最大，幾乎鋪滿整個(gè)平板，其余各個(gè)菌株產(chǎn)生的透明圈大小不一。各個(gè)菌株水解淀粉的能力各不相同，3＃、7＃、9＃三個(gè)菌株水解淀粉的能力最強(qiáng)，在初步篩選出的12株地衣芽孢桿菌中，5＃菌株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)，21＃產(chǎn)淀粉酶能力較差。透明圈如圖1,2,3,4,5,6。