|
專利名稱一種枯草芽孢桿菌活菌制劑及其制做方法 技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種微生物制劑及其制做方法。。 我國50年代開始生產(chǎn)治療腸道消化不良及腸炎的腸球菌制劑乳酶生和酵母片等。到八十年代由于抗生素大量廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥性菌株的大量出現(xiàn)及菌群失調(diào)性腹瀉增多，此時臨床醫(yī)生更關(guān)注生態(tài)防治。多年來應(yīng)用人體的非芽孢菌如乳酸、雙歧菌、腸球菌等做成的制劑雖有一定療效，但由于該類制劑中的細(xì)菌成活率低、保存期短、療效也不令人滿意，一直困繞著生物藥品業(yè)的發(fā)展。這樣尋找安全、有效、保存期長的微生物菌株及其微生物藥品，已成為各科學(xué)家探求的方向。 本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌活菌制劑及其制做方法，該制劑對人體安全、有效、不易產(chǎn)生耐藥性，無異味、保存期長的微生態(tài)制劑，用于治療因各種因素引起的消化不良、急、慢性腸炎及菌群失調(diào)性腹瀉。尤其是對出血型大腸桿菌感染性腸炎的治療更為有效。其制做方法簡單、成本低、易于實施。 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案這種枯草芽孢桿菌活菌制劑的組份的重量比為枯草芽孢桿菌BS-3菌株的原菌粉為1.5-2.5份(重量份數(shù))賦形劑為96-100份(重量份數(shù))，其中枯草芽孢桿菌BS-3菌株的原菌粉中的活菌數(shù)為≥200億個活菌/克。 所述賦形劑為乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖與可溶性淀粉的重量比為乳糖 9-11份(重量份數(shù))可溶性淀粉87-89份(重量份數(shù))還有，所述原菌粉是由濕菌體和無水碳酸鈣按1∶3重量比混勻干燥制成的。 該枯草芽孢桿菌活菌制劑可以是于粉制劑或膠囊制劑，或其它形式的制劑。其中在干粉制劑中，一般采用0.25克/袋或50克/袋，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為≥1.0×108個活菌/克。而在膠囊制劑中，一般采用0.25克/粒，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為≥1.0×108活菌/克。 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌活菌制劑是經(jīng)過下述方法制成的(1)生產(chǎn)菌種活化檢定無菌啟開枯草芽孢桿菌BS-3的凍干菌種，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中管內(nèi)，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，然后劃線轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)平板，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，挑典型菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)與特性檢定，(2)種液的制備將上述檢定合格的純培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶內(nèi)，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，進(jìn)行純菌及菌形特征檢查，(3)配制培養(yǎng)基將牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉加入蒸餾水中，上述各組份在蒸餾水中按1000毫升的溶液所含的重量(g)的組份配制牛肉膏4-6克/1000毫升，蛋白胨9-11克/1000毫升，葡萄糖9-11克/1000毫升、氯化鈉4-6克/1000毫升，將上述混合物加熱溶解后，調(diào)PH為7.0-7.2，15磅壓力下滅菌20-30分鐘，即制成培養(yǎng)菌液，(4)接種培養(yǎng)將上述檢定合格的種子液按1-3％的體積比例接種至上述培養(yǎng)液中，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)48-72小時，檢查芽孢形成的比率，并要求生孢率達(dá)90％以上，(5)收集菌體將上述培養(yǎng)到期的培養(yǎng)物，經(jīng)純菌試驗確認(rèn)無雜菌污染后，離心棄上清，然后收集濕菌體，(6)制備原菌粉用滅菌的無水碳酸鈣與上述濕菌體混合攪拌成濕菌粉，之后在70℃-80℃條件下干燥，研磨成干粉即原菌粉，所述原菌粉的活菌數(shù)控制為≥200億個活菌/克，(7)拌粉將上述原菌粉按上述重量比例加入滅菌過篩的賦形劑，充分?jǐn)噭蚝?，即制成枯草芽孢桿菌活菌制劑，該制劑的活菌數(shù)為≥1億個活菌/克。 在該制做方法中，所述的賦形劑為乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖與可溶性淀粉在該活菌制劑中的重量份數(shù)比為乳糖 9-11份(重量份數(shù))可溶性淀粉 87-89份(重量份數(shù))還有，所述濕菌體和無水碳酸鈣按1∶3重量比混勻。 在該制做方法中，所述枯草芽孢桿菌活菌制劑采用袋裝，即制成枯草芽孢桿菌活菌干粉制劑。 在該制做方法中，述枯草芽孢桿菌活菌制劑置于膠囊罐裝機內(nèi)罐裝，壓板、包裝，即制成枯草芽孢桿菌活菌膠囊制劑。 本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus Subtilis BS-3)的菌體形態(tài)，用鏡檢觀察該菌株呈桿狀，直、單個排列，很少成鏈狀。革蘭氏染色陽性(G+)大小為0.6～0.7×1.5-2.0um，側(cè)生鞭毛，中生芽孢呈橢圓形，孢囊不膨大，孢內(nèi)無PHB顆粒。該菌株分別經(jīng)中科院微生物研究所及中國藥品生物制品檢定所鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。并于97年9月3日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物的中心保藏，編號為CGMCC.NO.0321。 本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus Subtilis BS-3)在普通營養(yǎng)肉湯及普通肉湯瓊脂平板上均可以培養(yǎng)，在18℃-45℃培養(yǎng)溫度下均能生長，最適的生長溫度為30-37℃，培養(yǎng)條件PH值為5-8，最適的生長PH值為6.5-7.4。該菌株在普通營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生較強的淀粉酶、蛋白酶、桿菌肽類抗菌物質(zhì)，且具有抑制和殺滅血型大腸桿菌0157的能力。 本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus Subtilis BS-3)是采用下述方法分離培養(yǎng)的1、菌株的來源申請人從市場上購買了兩袋南效乳品廠生產(chǎn)的鮮牛奶，置于4-10℃冰箱中，次日實驗時發(fā)現(xiàn)其中一袋牛奶發(fā)生變質(zhì)，即牛奶發(fā)生凝固且有乳清液析出，經(jīng)對該變質(zhì)牛奶進(jìn)行初步細(xì)菌學(xué)直接涂片染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有一種革蘭氏陽性桿菌。 2、分離培養(yǎng)將上述變質(zhì)牛奶接種于普通肉湯或普通瓊脂培養(yǎng)基，采用常規(guī)的方法培養(yǎng)出本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus SubtilisBS-3)。 本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus Subtilis BS-3)經(jīng)實驗體外對腸出血性大腸桿菌(EHEC0157)有明顯的拮抗作用。24-48小時即顯示抑殺作用。48小時以后隨著培養(yǎng)時間的延長到96小時抑殺作用顯著增強。其實驗過程如下1、所用材料(1)大腸桿菌菌種腸出血性大腸桿菌0157(EHEC0157)，菌號88-2364。由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所提供。 (2)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌活菌膠囊規(guī)格0.25克/粒(枯草芽孢桿菌活菌≥1.0×108個/克)(3)培養(yǎng)基a、普通肉湯培養(yǎng)基b、大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基(EMB)干燥培養(yǎng)基每瓶250克。由中國藥品生物制品檢定所提供。 c、7％NaCl瓊脂培養(yǎng)基2方法(1)預(yù)備試驗測定出EHEC0157細(xì)菌的對數(shù)生長曲線。 (2)EHEC0157菌液的制備 接種EHEC0157菌于30毫升的肉湯培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃水浴恒溫振蕩，培養(yǎng)15小時(此時為該菌的對數(shù)生長期)。用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌濁度管比濁測定培養(yǎng)液中每毫升相當(dāng)EHEC0157菌數(shù)。然后用肉湯將換算出原培養(yǎng)液中EHEC0157菌數(shù)稀釋調(diào)整為每毫升約含1×108個菌。 (3)枯草芽孢桿菌活菌膠囊懸液的制備在無菌操作間稱取膠囊菌粉2.0克，加肉湯18毫升。混勻后(每毫升約含枯草芽孢桿菌1×108個菌)。 (4)實驗操作步驟a、取兩個滅菌三角燒瓶，分別為實驗瓶及對照瓶。實驗瓶中加入EHEC0157菌液(1×108個菌/毫升)9.0毫升。再加入枯草芽孢桿菌膠囊懸液(搖勻)9.0毫升?；靹蚝笕?.0ml，10倍系列稀釋至10-9，測定枯草芽孢桿菌數(shù)，作為0小時枯草芽孢桿菌活菌基數(shù)，37℃水浴振蕩培養(yǎng)。 對照瓶中加入EHEC0157菌(1×108個菌/毫升)9.0毫升，再加肉湯9.0毫升。充分混勻后取1.0毫升加肉湯9.0毫升，按10倍系列稀釋至10-9。每個稀釋度各取0.1毫升，另入EMB瓊脂平皿上(雙份)經(jīng)“L”棒涂抹后，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，平皿上計數(shù)為大腸菌落數(shù)，以此作為O小時三角瓶內(nèi)EHEC0157基礎(chǔ)數(shù)。 b、菌數(shù)變化觀察分別以下不同培養(yǎng)時間(0、24、48、72、96小時)測定實驗組與EHEC0157對照組中EHEC0157的菌數(shù)。(CFU/ml)3、實驗結(jié)果表1枯草芽孢桿菌活菌制劑在試管內(nèi)拮抗EHEC0157的結(jié)果組別 不同培養(yǎng)時間 (小時) EHEC0157 菌數(shù)/ml (logn)0 24 48 7296試驗組活菌制劑 8.3979 7.1760 7.2041 5.00004.7993+EHEC對照組 8.3979 9.3979 9.1461 8.76348.5682統(tǒng)計學(xué)分析 實驗組與對照組的活菌計數(shù)(T檢驗) P＜0.05 有顯著性差異從表1中結(jié)果可以看出試驗組0小時EHECO157菌數(shù)對數(shù)值為8.3979，作用24小時后即下降為7.1760，對照組由0小時的8.3979，增殖為9.3979。作用至96小時，試驗組EHEC0157菌數(shù)降至4.7993，對照組僅下降至8.5682，統(tǒng)計分析有顯著差異，說明枯草芽孢桿菌活菌制劑在體外與EHEC0157作用24小時即有拮抗作用，48小時后，這種拮抗作用進(jìn)一步加強。 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus Subtilis BS-3)所制成的藥劑，治療人工實驗感染的小型豬，治愈率在80％以上，有效率100％，自然發(fā)病仔豬治療有效率達(dá)90％。其實驗過程如下1、所用材料(1)實驗感染小型豬經(jīng)產(chǎn)毒性大腸桿菌(0149、K88)攻毒的20頭小型豬中，48小時內(nèi)發(fā)生腹瀉的共有18頭，患豬腹瀉的主要特征糞便稀，不成形，少數(shù)患豬糞便呈水樣，并伴有氣泡，經(jīng)過對18頭患豬的糞便采樣大腸桿菌培養(yǎng)，18頭患豬均分離出大腸桿菌，并與大腸桿菌(0149)O抗原分型血清及K因子血清呈陽性凝集反應(yīng)，證明患豬為大腸桿菌(0149K88)菌株感染。 (2)枯草芽孢桿菌活菌膠囊規(guī)格0.25克/粒(含活菌2.5億)。 (3)化藥瀉痢停粉劑，50克/袋，江蘇泰興市動物藥品廠生產(chǎn)。 2、治療方法與劑量方法采用菌粉或藥粉經(jīng)口腔直接灌飼法，對照組只感染不給藥同步觀察。 劑量枯草芽孢桿菌膠囊組每頭每次0.5克菌粉(約5億活菌)，每日2次，連續(xù)灌飼3天。 化藥瀉痢停組每頭每次1.0克藥粉，每日2次，連續(xù)灌飼3天。 療效指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn)(1)治愈用藥3天內(nèi)糞便成形、吃食正常、精神活潑7天無復(fù)發(fā)。 (2)有效用藥3天內(nèi)癥狀改善或減輕，糞便由稀變稠。 (3)無效用藥3天后癥狀未改善或加重或死亡。 觀察期實驗觀察治療期為7天。 3、實驗結(jié)果(1)枯草芽孢桿菌活菌膠囊治療實驗感染大腸菌小型豬腹瀉結(jié)果在人工實驗感染大腸桿菌(0149K88)的18頭患豬，經(jīng)兩種不同的藥物治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌活菌膠囊組治療6頭，治愈5頭，有效1頭，有效率為100％，化藥瀉痢停組治療6頭，治愈4頭，有效1頭，有效率為83.3％；未經(jīng)治療的對照組自然好轉(zhuǎn)1頭，其余5頭病豬中有1頭死亡，另1頭腹瀉癥狀加重，結(jié)果見表2。 表2 中國小型豬實驗感染大腸桿菌性腹瀉的治療結(jié)果組別試驗動物數(shù) 治愈數(shù) 有效數(shù)總有效率％(頭) (頭)％ 治愈+有效枯草芽孢桿菌6 5(833) 1(166) 100活菌制劑瀉痢停 6 4(66.6)1(16.6) 83.3對照組 6 0(0.0) 1(16.6) 16.6(2)不同活菌量的枯草芽孢桿菌膠囊治療小型豬實驗感染性腹瀉效果比較。 表3不同活菌量的枯草芽孢桿菌膠囊治療小型豬實驗感染性腹瀉效果比較。組別 試驗動物數(shù) 治愈數(shù)％有效數(shù)％ 總有效率％枯草芽孢桿菌 5 5(100) 0(0)10010×108枯草芽孢桿菌 5 5(100) 0(0)1005×108枯草芽孢桿菌 5 4(80) 1(20％) 1002.5×108從表3可以看出枯草芽孢桿菌活菌量為10億和5億時治愈率為100％，活菌量為2.5億時，治愈率為80％，總有效率為100％。 (3)大腸桿菌(0149 K88ac)實驗感染后，經(jīng)枯草芽孢桿菌膠囊治療7天小型豬腸道幾種主要菌群的改變。 表4枯草芽孢桿菌膠囊治療實驗感染小型豬7天腸道幾種主要菌群測定結(jié)果(每克濕糞的菌數(shù)log值)組別 細(xì)菌計數(shù)種類大腸桿菌 腸球菌乳桿菌 枯草芽孢桿菌治療組8.02 7.92 7.913.15正常組7.91 8.05 8.38表4結(jié)果表明患豬經(jīng)枯草芽孢桿菌活菌膠囊治愈7天檢測糞便中大腸桿菌數(shù)為8.02，腸球菌為7.92，枯草芽孢桿菌3.15，正常健康小型豬大腸桿菌為7.19。 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus subtilis BS-3)所制成的藥劑對初生仔豬腹瀉具有良好的預(yù)防作用，其保護(hù)率高達(dá)90％，即預(yù)防有效。其實驗過程如下材料與方法1、所用材料(1)懷孕待產(chǎn)小型豬母豬2頭，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小型豬繁育場提供。 (2)枯草芽孢桿菌活菌膠囊規(guī)格0.25克/粒(含活菌2.5億)。 2、方法將待產(chǎn)母豬分成實驗組及對照組，在實驗?zāi)肛i產(chǎn)仔豬出生后3-5小時內(nèi)立即灌飼枯草芽孢桿菌膠囊菌粉，每日2次，每次1粒(0.25克)，連續(xù)3天，對照組不給藥同步觀察。 觀察指標(biāo)仔豬腹瀉發(fā)生例數(shù)觀察期給藥3天觀察至第7天。 3、實驗結(jié)果應(yīng)用枯草芽孢桿菌活菌膠囊預(yù)防初生仔豬下痢的結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組有1例發(fā)病，發(fā)病率為10％，死亡數(shù)為0，保護(hù)率為90％，非預(yù)防對照組有6例病，發(fā)病率為60％，其中死亡3例，死亡率為30％，結(jié)果見表5。 表5枯草芽孢桿菌活菌膠囊預(yù)防初生仔豬下痢結(jié)果。組別實驗動物數(shù)發(fā)病例數(shù)5％ 死亡例數(shù)％ 保護(hù)例數(shù)％實驗組 10 1(10) 0(0)90對照組 10 6(60) 3(30) -本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus subtilis BS-3)屬于一種需氧芽孢菌，對人體及動物有益無毒付作用。該枯草芽孢桿菌BS-3菌株所制成的制劑經(jīng)中國藥品生物制品檢定所檢定未發(fā)現(xiàn)由該制劑給動物造成的異常反應(yīng)和病理改變。其檢定報告如下檢品名稱枯草芽孢桿菌活菌制劑。 規(guī)格0.25克/粒亞急性毒性試驗及一般觀察SPF級小鼠按2.500g/kg體重劑量，每日灌服枯草芽孢桿菌活菌連續(xù)灌胃10天。實驗組小鼠未見有中毒癥狀及死亡。小鼠活動自如，毛色光澤，食欲正常，口眼無分泌物，無嘔吐癥狀，糞便未見異常，體重增加。 血液檢查實驗小鼠血液中紅細(xì)孢、白細(xì)孢及血紅蛋白測定結(jié)果與對照組小鼠無明顯差異。 剖檢和病理學(xué)檢查實驗組及對照組小鼠經(jīng)解剖肉眼觀察，心、肝、脾、胃、肺、腎、腸未見異常，組織病理學(xué)切片鏡下觀察上述器官或組織也未見因該制劑引起的病變。 結(jié)論未發(fā)現(xiàn)由該制劑給動物造成的異常反應(yīng)和病理改變。 實施例(一)枯草芽孢桿菌BS-3菌株(Bacillus subtilis BS-3)分離。 1、樣本的來源樣本為前述變質(zhì)袋牛奶。 2、分離培養(yǎng)方法(1)分離用的培養(yǎng)基采用普通肉湯液體培養(yǎng)基，PH值為7.0-7.2；或是普通營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，PH值為7.0-7.2，經(jīng)15磅壓力，滅菌20分鐘制成。 (2)方法采用普通肉湯液體培養(yǎng)法無菌吸取上述變質(zhì)袋牛奶的0.1ml，接種于普通肉湯中管兩支，在37℃條件下培養(yǎng)18-24小時，觀察培養(yǎng)管中的變化。 采用普通營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基法用白金耳無菌挑取上述變質(zhì)袋牛奶一環(huán)，劃線于普通肉湯瓊脂平板兩塊分離，在37℃條件下培養(yǎng)18-24小時，觀察平皿內(nèi)細(xì)菌生長情況。 (3)分離結(jié)果在普通肉湯培養(yǎng)管中，培養(yǎng)液呈微混濁，培養(yǎng)管液面形成完整的一層菌膜，即細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性生長，涂片培養(yǎng)物革蘭氏染色均為G+桿菌，少數(shù)菌體有芽孢，位于菌體中央，呈橢圓形。經(jīng)檢定為枯草芽孢桿菌BS-3菌株。 在營養(yǎng)瓊脂平板上，兩塊平板均培養(yǎng)為陽性，菌落圓形不規(guī)則，乳脂色不透明，菌落直徑為2-4mm，經(jīng)革蘭氏染色為G+桿菌，大小約為0.6-0.7×1.5-2.0孔um芽孢中生，經(jīng)檢定為枯草芽孢桿菌BS-3菌株。 (二)生產(chǎn)菌種活化與檢定將上述枯草芽孢桿菌BS-3菌株接種于10ml普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中管內(nèi)，在35℃條件下培養(yǎng)18-24小時，然后用白金環(huán)挑一環(huán)劃線轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂平板，在35℃條件下培養(yǎng)18-24小時，挑典型菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)與特性檢定，并傳代培養(yǎng)。 (三)種子液的制備將檢定合格的純培養(yǎng)物，無菌吸取0.5ml接種于10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶內(nèi)，35℃條件下培養(yǎng)18-24小時，進(jìn)行純菌及菌形特征檢查。 (四)生產(chǎn)培養(yǎng)基將牛肉膏5克、蛋白胨10克、葡萄糖10克、氯化鈉5克加入蒸餾水中至1000毫升，將上述混合物加熱溶解后，調(diào)PH值為7.0-7.2，在15磅壓力下滅菌20分鐘。 (五)接種與培養(yǎng)前述種子液經(jīng)檢定合格后，按1-3％比例(體積比)接種在裝有上述培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，在35℃條件下培養(yǎng)48-72小時，檢查芽孢形成的比率。 (六)收集菌體將培養(yǎng)到期的培養(yǎng)物，要求生孢率達(dá)90％以上，再經(jīng)純菌試驗，確認(rèn)無雜菌污染。將上述培養(yǎng)物以4000rpm/分轉(zhuǎn)速離心20分鐘，棄上清，收集濕菌體。 (七)制備原菌粉將上述濕菌體與無水碳酸鈣按1∶3比例(重量比)混合攪拌成濕菌粉，在70-80℃條件下干燥，并研磨成干粉即原菌粉。該原菌粉的活菌數(shù)控制為≥200億個活菌/克。 (八)拌粉將上述原菌粉與滅菌過篩(篩孔為80目)的乳糖、可溶性淀粉按下述重量比混勻原菌粉2份，乳糖10份、可溶性淀粉88份，并充分?jǐn)噭?，其中上述菌粉混合物的活菌?shù)控制為≥1×108個活菌/克。并按0.25克/袋或50克/袋包裝成袋，制成枯草芽孢桿菌BS-3菌株的活菌干粉制劑。 (九)罐裝膠囊上述菌粉混合物也可以制成活菌膠囊制劑，將菌粉混合物置于膠囊罐裝機內(nèi)罐裝，壓板、包裝，制成枯草芽孢桿菌BS-3菌株的活菌膠囊制劑，其中每粒膠囊為0.25克/粒。 綜上所述，本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌BS-3菌株可制成活菌干粉制劑、活菌膠囊制劑或其它形式的制劑，可治療人、動物的因各種因素引起的消化不良，急、慢性腸炎及菌群失調(diào)性腹瀉。尤其對出血型大腸桿菌感染性腸炎治療更為有效。該制劑也可作為醫(yī)藥保健品，獸藥和飼料添加劑。該制劑對人體安全、有效、不易產(chǎn)生耐藥性、無異味、保存期長。其制做方法簡單、成本低、易于實施。 權(quán)利要求 1.一種枯草芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于該藥劑中各組份的重量比為枯草芽孢桿菌BS-3菌株的原菌粉為1.5-2.5份(重量份數(shù))賦形劑為96-100份(重量份數(shù))，其中枯草芽孢桿菌BS-3菌株的原菌粉中的活菌數(shù)為≥200億個活菌/克。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于所述賦形劑為乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖與可溶性淀粉的重量比為乳糖 9-11份(重量份數(shù))可溶性淀粉 87-89份(重量份數(shù))還有，所述原菌粉是由濕菌體和無水碳酸鈣按1∶3重量比混勻干燥制成的。 3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑，其特征在于所述制劑為干粉制劑或膠囊制劑。 4.制做權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑的方法，其特征在于該枯草芽孢桿菌活菌制劑是經(jīng)過下述方法制成的(1)生產(chǎn)菌種活化檢定無菌啟開枯草芽孢桿菌BS-3的凍干菌種，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中管內(nèi)，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，然后劃線轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)平板，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，挑典型菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)與特性檢定，(2)種子液的制備將上述檢定合格的純培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶內(nèi)，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)18-24小時，進(jìn)行純菌及菌形特征檢查，(3)配制培養(yǎng)基將牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉加入蒸餾水中，上述各組份在蒸餾水中按1000毫升的溶液所含的重量(g )的組份配制牛肉膏4-6克/1000毫升，蛋白胨9-11克/1000毫升，葡萄糖9-11克/1000毫升、氯化鈉4-6克/1000毫升，將上述混合物加熱溶解后，調(diào)PH為7.0-7.2，15磅壓力下滅菌20-30分鐘，即制成培養(yǎng)菌液，(4)接種培養(yǎng)將上述檢定合格的種子液按1-3％的體積比例接種至上述培養(yǎng)液中，在20℃-45℃條件下培養(yǎng)48-72小時，檢查芽孢形成的比率，并要求生孢率達(dá)90％以上，(5)收集菌體將上述培養(yǎng)到期的培養(yǎng)物，經(jīng)純菌試驗確認(rèn)無雜菌污染后，離心棄上清，然后收集濕菌體，(6)制備原菌粉用滅菌的無水碳酸鈣與上述濕菌體混合攪拌成濕菌粉，之后在70℃-80℃條件下干燥，研磨成干粉即原菌粉，所述原菌粉的活菌數(shù)控制為≥200億個活菌/克，(7)拌粉將上述原菌粉按上述重量比例加入滅菌過篩的賦形劑，充分?jǐn)噭蚝螅粗瞥煽莶菅挎邨U菌活菌制劑，該制劑的活菌數(shù)為≥1億個活菌/克。 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑的制做方法，其特征在于所述的賦形劑為乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖與可溶性淀粉在該活菌制劑中的重量份數(shù)比為乳糖9-11份(重量份數(shù))可溶性淀粉 87-89份(重量份數(shù))還有，所述濕菌體和無水碳酸鈣按1∶3重量比混勻。 6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑的制做方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌活菌制劑采用袋裝，即制成枯草芽孢桿菌活菌干粉制劑。 7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的枯草芽孢桿菌活菌制劑的制做方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌活菌制劑置于膠囊罐裝機內(nèi)罐裝，壓板、包裝，即制成枯草芽孢桿菌活菌膠囊制劑。 全文摘要 本發(fā)明涉及一種微生物制劑及其制做方法。該制劑是采用下述組分及重量比制成的:枯草芽孢桿菌BS－3菌株(Bacillus subtilis BS－3)與無水碳酸鈣的混合物的原菌粉1.5—2.5份(其中該原菌粉所含活菌數(shù)為≥200億個活菌/克)乳糖9—11份,可溶性淀粉87—99份。經(jīng)菌種活化、種子液的制備、配制培養(yǎng)基,接種培養(yǎng)、制備原菌粉、拌粉等步驟制成活菌干粉、膠囊制劑?？芍委熛涣?、急、慢性腸炎及菌群失調(diào)性腹瀉。尤其對出血型大腸桿菌感染性腸炎治療更為有效。該方法簡單,成本低,易于實施。 文檔編號A61K47/36GK1177637SQ9711703 公開日1998年4月1日 申請日期1997年9月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月26日 發(fā)明者魏濤, 王煥芹 申請人:北京英特萊幸諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司 |
|
|
