自從發(fā)現(xiàn)HIV病毒以來，研究人員一直在尋求預(yù)防HIV感染和治療HIV的有效策略。經(jīng)過幾十年的努力后，目前研究人員把目光主要集中在三個領(lǐng)域：開發(fā)有效的疫苗，尋找毒性較低的抗病毒藥物，還有就是本文要探討的主要內(nèi)容—通過修改宿主細(xì)胞的基因，使它們不能被病毒感染。從而到達(dá)治療的目的。

該篇小型的評論性文章總結(jié)了該領(lǐng)域的臨床研究結(jié)果，并展望了該方法的臨床前景。文章發(fā)表在2014年7月9日的JAMA上。

至目前為止，疫苗和藥物治療功能性治愈HIV（患者不再需要服用藥物）的能力有限。基因編輯這一技術(shù)可以幫助患者達(dá)到功能性治愈的目標(biāo)。該技術(shù)主要針對免疫細(xì)胞表面的HIV特定受體，目前在實驗室中已經(jīng)成功，有些已經(jīng)進(jìn)入早期的臨床試驗。

1、已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗的CCR5敲除法


圖 HIV侵入宿主細(xì)胞需要CD4受體和輔助受體CCR5，抑制CCR5的表達(dá)可以功能性治愈HIV患者

當(dāng)病毒侵入免疫系統(tǒng)的CD4 T細(xì)胞時，病毒必須需要至少2個受體，第一個為細(xì)胞表面的CD4糖蛋白，然后是2個輔助受體中的一個，CCR5或CXCR4。

約有1%的歐洲人可以抵抗HIV病毒，因為他們是CCR5基因突變的純合子。該突變?yōu)镃CR5-Δ32突變，它可以使CCR5這個小蛋白不再在細(xì)胞表面表達(dá)。

幾年前，研究人員發(fā)現(xiàn)，一例柏林患者在接受CCR5-Δ32突變供體的骨髓移植后，其艾滋病和白血病都得到了治愈。因為很難找到CCR5-Δ32突變的骨髓移植捐助者，干細(xì)胞移植治療尚不能大規(guī)模運用。

因此，研究人員一直致力于開發(fā)新的技術(shù)，并使其能在臨床上大量運用。例如，通過病毒載體或其他方法干擾CCR5 RNA的產(chǎn)生。

通過抑制或消除CD4+T細(xì)胞表面的CCR5輔助受體的表達(dá)來達(dá)到CCR5 -Δ32突變的治療效果，這是一個“古老”的想法。以前的主要問題是通過何種手段來實現(xiàn)CCR5消除或抑制。

研究人員曾試圖利用CCR5胞內(nèi)抗體（胞內(nèi)抗體，一個特定的目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)抗原）或小干擾RNA。但是這些方法的效果都不好。基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)很好地解決了該問題。該方法通過核酸酶特異性地切除某一目的基因，從而使該基因的表達(dá)受阻。

南加州大學(xué)Paula Cannon博士及其團(tuán)隊已經(jīng)使用這種核酸酶—鋅指核酸酶在人類造血干細(xì)胞中敲除了CCR5基因。他們把敲除后的干細(xì)胞移植到一個“人源化”的小鼠模型（轉(zhuǎn)基因小鼠具有人類的免疫系統(tǒng)）中，這些干細(xì)胞可以分化成多種血細(xì)胞，同時保留了CCR5缺失的特性。研究人員用HIV感染小鼠，病毒的復(fù)制受到抑制，人類T細(xì)胞保持在正常水平。

這種方法的一個優(yōu)點是干細(xì)胞能不斷分化出新的CD4陽性T細(xì)胞，從而有效抵抗病毒的感染，隨著時間的推移，這些細(xì)胞存活下來，并逐漸主導(dǎo)，使宿主能到抵抗病毒感染。Paula Cannon博士及其團(tuán)隊正在對此進(jìn)行臨床試驗。

June及其同事最近完成了一個使用相同方法的臨床試驗，但不是針對造血干細(xì)胞，而是自身CD4細(xì)胞。在該項研究中，12例慢性HIV感染者接受了一百億個自體CD4細(xì)胞（11%-28%進(jìn)行了CCR5基因敲除）。出現(xiàn)1例嚴(yán)重不良反應(yīng)事件是由于輸血反應(yīng)。1周時，平均CD4細(xì)胞計數(shù)為1517/μL，是注射前（448次/μL）的3倍還多。

據(jù)估計，一周后外周血中8.8%的循環(huán)單核細(xì)胞和13.9%的CD4細(xì)胞為CCR5缺失的細(xì)胞。這些細(xì)胞的平均半衰期為48周。6例患者在輸注CD4細(xì)胞4周后，中斷了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。

在中斷期內(nèi)，循環(huán)細(xì)胞中CCR5缺失的細(xì)胞數(shù)下降明顯慢于無CCR5缺失的細(xì)胞。在其中1例患者中，HIV RNA甚至下降到檢測線以下。在大多數(shù)患者中，血中HIV DNA水平都下降。

這是第1例在人類身上運用基因編輯技術(shù)。這項工作強(qiáng)烈提示我們，可以創(chuàng)造一個抵抗HIV感染的免疫系統(tǒng)。June對自己的研究成果很有信心。他們現(xiàn)在正在擴(kuò)大樣本量，并探索CCR5修飾T細(xì)胞的最佳劑量。

2、其他核酸酶的方法

與鋅指核酸酶類似，其他類型的核酸酶技術(shù)也可以在人類細(xì)胞中編輯靶向基因，具有較高的特異性和較低的細(xì)胞毒性。例如，可編程的、序列特異性的DNA結(jié)合酶—類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶，簡稱為TALEN。在實驗室中已經(jīng)成功敲除CCR5基因。

另一個新的方法進(jìn)行CCR5基因編輯方法叫做CRISPR。此系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。

而通過人工設(shè)計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引導(dǎo) Cas9 對 DNA 的定點切割。這種方法是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。

加利福尼亞大學(xué)的Yuet Kan博士最近使用這個系統(tǒng)使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo(hù)性CCR5基因的純合子。從這些細(xì)胞分化而來的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以抵抗HIV感染。

從理論上講，基因編輯的干細(xì)胞可以在病人體內(nèi)產(chǎn)生抗HIV的白細(xì)胞和T細(xì)胞，最終導(dǎo)致病人被治愈。該方法沒有抗逆轉(zhuǎn)錄病藥物的毒性，不像疫苗需要一個健康的免疫系統(tǒng)，具有良好的臨床前景。但是目前的挑戰(zhàn)是如何將iPSCs誘導(dǎo)為適合移植的造血干細(xì)胞，還有iPSCs潛在的遺傳異常和致瘤性。

專家們擔(dān)心使用核酸酶技術(shù)敲除CCR5基因可能也有潛在的“脫靶”效應(yīng)，可能影響其他所有基因的表達(dá)。所有的核酸酶技術(shù)都有一定程度的脫靶效應(yīng)。特別是高度同源DNA序列。但是目前對于任何給定的靶基因都有多種核酸酶，可以確定一種臨床上安全的方法。

Picker指出，理論上通過移植患者自身經(jīng)過CCR5修飾的干細(xì)胞可以達(dá)到治愈的目標(biāo)。但是實際上，這種方法還是有點另人懷疑，因為干細(xì)胞移植很危險。這種方法可以在人類身上試試，可能有效。但指望該法解決HIV問題，可能不太現(xiàn)實。

3、聯(lián)合敲除基因

研究人員也把CXCR4基因作為一種抗HIV的策略。通過藥物或基因操作抑制CCR5或CXCR4的表達(dá)，只能保護(hù)細(xì)胞不受相應(yīng)株HIV的感染，這有利于另一種HIV的生長。

因此，June和他的同事用鋅指核酸酶同時編輯人CD4細(xì)胞中的CCR5和CXCR4基因。當(dāng)這些修改后的細(xì)胞移植入人源化的小鼠，可以保護(hù)小鼠免受CCR5和CXCR4 HIV-1的感染。

雖然理論上同時敲除兩種受體可能確實比單一的CCR5要強(qiáng)。研究人員發(fā)現(xiàn)，在柏林患者體內(nèi)的少量HIV病毒為CXCR4型。但是這種病毒在柏林患者移植CCR5缺失的干細(xì)胞和停止服用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物后沒有出現(xiàn)大量復(fù)制。

研究人員最近證明這種病毒不能在缺失CCR5的細(xì)胞中復(fù)制。因此，CCR5可能不單單是一個HIV進(jìn)入細(xì)胞的第二受體。

盡管CCR5是病毒在宿主內(nèi)復(fù)制的重要因素，但CCR5突變不是機(jī)體抵抗HIV感染的全部。因為有許多CCR5正常的HIV感染者可以清除HIV感染。這說明其他基因也起了關(guān)鍵的作用。科學(xué)家們在努力地工作，以確定這些基因。

不同人群在HIV感染后的不同臨床結(jié)局，通過研究他們之間的遺傳差異可能會有令人難以置信的發(fā)現(xiàn)。然后通過基因敲除技術(shù)，可以使這些新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為新的治療措施 。