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1．怎樣按照使用濃度溶解引物？ 了解以下幾個(gè)參數(shù)：
1OD引物干粉約為33微克；
堿基的平均分子量為324.5；
引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量；
引物的摩爾數(shù)=質(zhì)量數(shù) / 引物分子量
舉例：如果您拿到一管標(biāo)明為2OD的20堿基的引物，
分子量=20 x 324.5=6490 質(zhì)量數(shù)=2 x 33 =66μg
摩爾數(shù)=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol
若您需要溶解為10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。
同時(shí)請(qǐng)您注意：真空干燥的DNA呈干膜狀或粉末狀在離心管底部，開(kāi)啟瓶蓋時(shí)小心不要丟失；請(qǐng)加入足量的水充分振蕩溶解。
2．引物（含修飾）的分子量是如何確定的？ 非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報(bào)告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計(jì)一個(gè)引物的分子量按每個(gè)堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接?jì)算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團(tuán)的數(shù)目和分子量。
對(duì)于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量16。
常規(guī)堿基分子量
| Base | Molecular Weight |
|---|
| A | 313.21 | | C | 289.18 | | G | 329.21 | | T | 304.19 | | I | 314.2 | | U | 290.17 |
常規(guī)修飾基團(tuán)分子量
| 常規(guī)修飾基團(tuán) | 分子量 | 常規(guī)修飾基團(tuán) | 分子量 |
|---|
| 5’-Biotin | 405.45 | 3’-TAMARA | 623.60 | | 5’-(6 FAM) | 537.46 | 3’-Dabsyl | 498.49 | | 5’-HEX | 744.13 | 3’-(6 FAM) | 569.46 | | 5’-TET | 675.24 | 3’-Amino Modifier C3 | 153.07 | | 5’-Cy5 | 533.63 | 3’-Amino Modifier C7 | 209.18 | | 5’-Cy3 | 507.59 | 3’-Thiol Modifier C3 | 154.12 |
3．如何計(jì)算引物的Tm值？ 引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，引物長(zhǎng)度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。
長(zhǎng)度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物長(zhǎng)度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。
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