在實(shí)際的測(cè)序中，現(xiàn)在反應(yīng)體系當(dāng)中，加入要測(cè)序的DNA模板，一般是經(jīng)過(guò)純化的質(zhì)粒或者經(jīng)過(guò)純化好的PCR擴(kuò)增片段，再加入與測(cè)序起始位置已知序列相互補(bǔ)的測(cè)序引物DNA，也就是Primer，測(cè)序Primer在這里起的作用，是與模板的特定序列位置相結(jié)合。引導(dǎo)聚合反應(yīng)發(fā)生。并且，它還可以確保：DNA的聚合反應(yīng)是從已知的、確定的起點(diǎn)開(kāi)始。然后加入BigDye試劑，進(jìn)行反應(yīng)。

BigDye試劑當(dāng)中，包括了我們所說(shuō)的“四種熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸”，dNTP和DNA聚合酶。另外還包含鎂離子、PH緩沖液等。反應(yīng)過(guò)程當(dāng)中，聚合酶從Primer處開(kāi)始進(jìn)行聚合反應(yīng)，熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸和天然dNTP，遵照堿基互補(bǔ)的原則。延著模板，一個(gè)一個(gè)地被聚合到新合成的DNA鏈上去。

每聚合一個(gè)新的堿基，都有兩種可能。

第一種可能是結(jié)合進(jìn)了一個(gè)正常的與模板互補(bǔ)的dNTP，這時(shí)候聚合反應(yīng)就可以進(jìn)行下去，另外一種可能，是結(jié)合進(jìn)行一個(gè)與模板互補(bǔ)，但是雙脫氧的、熒光標(biāo)記的ddNTP，當(dāng)DNA鏈中被結(jié)合進(jìn)了一個(gè)ddNTP的時(shí)候，鏈的延伸就被終止了。同時(shí)BigDye的熒光基團(tuán)也就被加到這個(gè)DNA鏈的3’位末端，并且這個(gè)熒光基團(tuán)的顏色，與模板對(duì)應(yīng)位置的堿基種類(lèi)，有對(duì)應(yīng)的關(guān)系。

整個(gè)反應(yīng)當(dāng)中，產(chǎn)生了一系列長(zhǎng)長(zhǎng)短短的帶有熒光標(biāo)簽的DNA片段混合物。接著這些DNA片段的混合物，經(jīng)過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的純化，去掉游離的熒光ddNTP單核苷酸，留下有一定長(zhǎng)度的DNA片段，就可以上機(jī)測(cè)序了。上機(jī)測(cè)序過(guò)程當(dāng)中，現(xiàn)在一根長(zhǎng)長(zhǎng)的、中空的玻璃毛細(xì)管當(dāng)中注入丙烯酰胺溶液，接著用紫外光照射丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外線的電離作用下發(fā)生聚合反應(yīng)。變成聚丙烯酰胺凝膠，在電場(chǎng)條件下聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于在其中電泳的核酸，有分離作用。短的片段在聚丙烯酰胺凝膠當(dāng)中電泳的快，長(zhǎng)的DNA片段則電泳的慢。

然后把DNA片段混合物加到有聚丙烯酰胺凝膠的毛細(xì)管的一端，在毛細(xì)管的兩端加上高電壓，DNA片段在電池的作用下，從負(fù)極到正極電泳。在毛細(xì)管正極的末端用激光進(jìn)行照射并用分光的光學(xué)傳感器把不同顏色的熒光強(qiáng)度記錄下來(lái)。

每個(gè)激光的片段，在通過(guò)激光的掃描點(diǎn)時(shí)，它上面帶有的熒光基團(tuán)就會(huì)發(fā)出特定顏色的熒光。因?yàn)樵谥暗木酆戏磻?yīng)當(dāng)中聚合反應(yīng)的起點(diǎn)都是從特定的引物位置開(kāi)始的，所以越先電泳到達(dá)激光掃描點(diǎn)的DNA片段，就是越短的片段。它的聚合終止位置離聚合起始位置就越近。它所反應(yīng)的熒光顏色就反映了它3’端末端的那個(gè)堿基是A、C、G、T當(dāng)中的哪一種，那么反之，越慢電泳到搭激光掃描點(diǎn)的DNA片段，就是約長(zhǎng)的片段。它的終止位點(diǎn)就離引物的起始位置越遠(yuǎn)。

然后我們就得到了這樣有四種顏色的圖，圖的橫軸是電泳圖，縱軸是熒光的強(qiáng)度。四種顏色則對(duì)應(yīng)了四種堿基。那么橫軸既可以看作是電泳的時(shí)間，也可以看作是堿基的先后次序。沿著橫軸，我們可以根據(jù)峰的顏色，判斷出一次是哪種堿基。峰越高、越尖與別的峰的交錯(cuò)越少，則這個(gè)堿基判讀準(zhǔn)確性越好。

目前，用ABI 3500測(cè)序儀，一般可以測(cè)到850個(gè)堿基。用ABI 3730一般可以測(cè)到700個(gè)堿基。