https:///10.1002/imt2.14

引  言

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)已經(jīng)解析了人類復(fù)雜疾病的遺傳機(jī)制，極大地促進(jìn)了我們對(duì)疾病病因的理解，同時(shí)也促進(jìn)了基因療法的發(fā)展。然而，個(gè)體罹患復(fù)雜疾病病因復(fù)雜，遺傳學(xué)僅占其有限的一部分。例如，GWAS表明遺傳因素分別只占患2型糖尿病和克羅因病的6%和20%。近年來，腸道微生物組在人類復(fù)雜疾病發(fā)展中的作用逐漸得到認(rèn)可，并且成為一個(gè)蓬勃發(fā)展的研究領(lǐng)域。

人類腸道定植了大量的細(xì)菌、古菌、真核生物以及病毒，這些微生物總數(shù)和人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，統(tǒng)稱為“微生物組”。腸道微生物組參與消化食物、訓(xùn)練宿主免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌功能、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、改變藥物代謝以及清除毒素等反應(yīng)，此外還會(huì)產(chǎn)生大量影響宿主的化合物。在以小鼠為對(duì)象的研究中，腸道微生物在無菌動(dòng)物模型發(fā)展至炎癥性腸病(IBD)中至關(guān)重要。在人類研究中，患有免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病母親的嬰兒呈現(xiàn)出不一樣的腸道微生物組成，可能進(jìn)一步引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)。所有的證據(jù)都表明了腸道微生物組在復(fù)雜疾病發(fā)展中的關(guān)鍵作用。

宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和大型隊(duì)列研究使我們能夠?qū)⒛c道微生物組與宿主臨床表型相結(jié)合，從而識(shí)別候選疾病相關(guān)的微生物特征。近年來，大量的腸道微生物組成和復(fù)雜疾病之間的相關(guān)性研究陸續(xù)發(fā)表，包括但不限于心血管疾病、糖尿病、炎癥性腸病、過敏以及癌癥。與人類基因組不同，腸道微生物組有一定的可操作性，因此腸道微生物組正在逐漸成為疾病預(yù)防和治療的靶點(diǎn)。然而，學(xué)術(shù)研究與臨床轉(zhuǎn)化之間仍存在巨大距離，比如不同研究之間的疾病特異性微生物組缺乏一致性，因果推斷較差，以及當(dāng)前基于微生物組的治療在患者中的效率不盡人意（例如，糞便微生物組移植（FMT）和益生菌的使用）等。這可能是由于1）許多腸道細(xì)菌具有不確定性，甚至在特定條件下會(huì)表現(xiàn)出相反的表型；2）大部分研究都聚焦于微生物組成，但這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)椴煌膩喰捅硇鸵膊槐M相同?；诮獯a微生物基因組的功能分析發(fā)現(xiàn)，cutC/D等微生物基因參與苯乙酰谷氨酰胺和氧化三甲胺(TMAO)的合成，而這兩種代謝物是誘發(fā)CVD的危險(xiǎn)因素。因此，除了腸道微生物組成，我們更應(yīng)該深入進(jìn)行功能分析，從而解決以上問題。

本文綜述了近年來與人類健康和疾病相關(guān)的腸道微生物組研究進(jìn)展，特別關(guān)注其潛在功能，主要包括微生物膜的毒力因子、衍生的小分子以及藥物代謝。與此同時(shí)，常用解碼微生物基因組功能的分析工具也被提及。最后，我們還介紹了領(lǐng)域內(nèi)的前沿技術(shù)，或許可以幫助我們更好理解微生物組在人類復(fù)雜疾病中的機(jī)制，促進(jìn)基于腸道微生物組的個(gè)性化醫(yī)學(xué)發(fā)展。

影響人類健康和疾病的微生物功能

特殊的菌體結(jié)構(gòu)

腸道微生物往往具備耐藥性和毒性的基本結(jié)構(gòu)，比如鞭毛、菌毛、莢膜、孢子及生物膜等，是腸道內(nèi)數(shù)以億計(jì)細(xì)菌生存和活動(dòng)的基礎(chǔ)，其對(duì)宿主的直接影響可以歸因于此（圖1）。

菌毛是從細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)生的直絲。鞭毛比菌毛長(zhǎng)，可以旋轉(zhuǎn)并產(chǎn)生推力，推進(jìn)細(xì)菌向前移動(dòng)。菌毛和鞭毛的形成往往由基因簇編碼，且不同物種之間差異很大。例如，在菲姆沙門氏菌和大腸桿菌中分別鑒定出10個(gè)和6個(gè)鞭毛形成基因。即使兩者都可以侵染宿主，但背后的機(jī)制不盡相同。許多細(xì)菌病原體都是靠機(jī)動(dòng)性來感染宿主，因此鞭毛在這一過程中起著關(guān)鍵作用。與鞭毛不同，菌毛攜帶毒力因子，幫助細(xì)菌粘附在人類細(xì)胞上。例如，百日咳博德氏菌利用其黏附素與纖毛呼吸細(xì)胞結(jié)合，引起百日咳。淋病奈瑟菌的菌毛幫助其與宮頸細(xì)胞和頰部細(xì)胞結(jié)合，引起淋病。如果沒有菌毛幫助結(jié)合人腸道上皮細(xì)胞，大腸桿菌和空腸彎曲桿菌就不能引起腹瀉。

莢膜是位于細(xì)胞膜外的多糖層，也是細(xì)菌細(xì)胞外膜的一部分。莢膜普遍存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中，和僅在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的脂多糖和脂蛋白形成的二層脂膜不同。莢膜可以保護(hù)細(xì)菌免受機(jī)械損傷和環(huán)境變化（如溫度、干燥、噬菌體和真核細(xì)胞）的危害。它還有助于細(xì)菌粘附在光滑的表面上。例如，可以導(dǎo)致齲齒的變形鏈球菌通過其莢膜附著在牙齒表面。莢膜也是病原微生物入侵宿主免疫系統(tǒng)并防止它們被巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬的必要條件。一項(xiàng)研究表明，肺炎鏈球菌莢膜的厚度與腦膜炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。在真菌感染期間，莢膜與真菌細(xì)胞壁上的β-葡聚糖相互作用，激活宿主dectin-1相關(guān)的CARD9信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)炎癥。然而，莢膜材料也被成功應(yīng)用于疫苗接種，如肺炎鏈球菌疫苗和流感嗜血桿菌疫苗。

不同于莢膜，孢子是一類異常堅(jiān)固的細(xì)胞并能保護(hù)細(xì)菌免受極端條件的影響。因此，孢子可以保護(hù)致病菌免受抗生素等影響，從而產(chǎn)生毒力因子。芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌是最常見的產(chǎn)生孢子的細(xì)菌，并可誘發(fā)多種感染性疾病。例如，蠟樣芽孢桿菌的孢子可以在不同溫度下存活從而引起食源性疾病。炭疽桿菌的孢子通過產(chǎn)生炭疽毒素和形成多聚γ-d-谷氨酸，引起皮膚和胃腸道吸入炭疽，從而保護(hù)細(xì)菌逃避免疫監(jiān)視避免被吞噬。

生物膜可以被認(rèn)為是一類能夠自產(chǎn)胞外聚合物基質(zhì)的細(xì)菌菌落，能夠保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受外部不利因素的影響，如溫度變化、脫水和殺菌劑等。細(xì)菌生物膜通常具有致病性，據(jù)估計(jì)，高達(dá)80%的人類微生物感染，包括心內(nèi)膜炎，囊性纖維化，牙周炎，鼻竇炎，骨髓炎，未愈合的慢性傷口，腦膜炎，腎臟感染和植入式裝置相關(guān)感染等，都與生物膜形成相關(guān)。許多細(xì)菌都可以形成生物膜，最常見的包括大腸桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠色鏈球菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌和銅綠假單胞菌等。值得注意的是，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌會(huì)導(dǎo)致約50%的假體心臟瓣膜感染、70%的導(dǎo)管生物膜感染和80%的血流感染。不幸的是，單獨(dú)使用抗生素治療對(duì)生物膜引起的相關(guān)感染沒有效果。這是因?yàn)?）生物膜可以延緩甚至阻止抗生素的滲透2）細(xì)菌可以通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得抗性3）使用藥物外排泵將抗生素從成熟的生物膜中泵入細(xì)胞外基質(zhì)中。此外，生物膜還可以通過分泌c-di-NMPs來激活先天免疫系統(tǒng)誘發(fā)免疫反應(yīng)，隨后激活1型IFNs。

圖1：引起微生物耐藥性和毒性的基本結(jié)構(gòu)

腸道微生物往往具備耐藥性和毒性的基本結(jié)構(gòu)，比如鞭毛、菌毛、莢膜、孢子及生物膜等結(jié)構(gòu)，是腸道內(nèi)數(shù)以億計(jì)細(xì)菌生存和活動(dòng)的基礎(chǔ)，直接對(duì)宿主造成影響。特定的微生物結(jié)構(gòu)可以幫助其附著人類細(xì)胞或受體，從而進(jìn)一步激活各種信號(hào)通路。此外，它們還可能還具有抗生素耐藥性、毒力因子、各種代謝物以及其他疾病相關(guān)分子

代謝分子

腸道微生物參與了一系列具有生物活性的代謝物合成和轉(zhuǎn)化，這些代謝物可以作為底物和信號(hào)分子，參與人類生理功能或者誘發(fā)復(fù)雜疾病。微生物相關(guān)代謝分子主要包括短鏈脂肪酸(SCFAs)、氨基酸(AAs)、維生素、膽汁酸(BAs)、毒素、花青素以及植物學(xué)雌激素等（圖2）。

短鏈脂肪酸(SCFAs)可以由結(jié)腸中的微生物通過發(fā)酵碳水化合物（如葡萄糖、淀粉和纖維等）或AAs（如賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）進(jìn)行合成。腸道微生物衍生的短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸。值得注意的是，乙酸、丙酸和丁酸占總SCFAs的95%以上，且在人體腸道中的摩爾比約為60：20：20。乙酸的生物合成主要依賴于編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶或乙酸激酶的基因。對(duì)于丙酸，則主要是由參與琥珀酸代謝途徑、丙烯酸酯代謝途徑和丙二醇代謝途徑的基因編碼。丁酸的生物合成主要來源于丙酮酸代謝途徑、4-氨基丁酸代謝途徑、戊二酸代謝途徑以及賴氨酸代謝途徑。丁酸的生產(chǎn)者包含很多物種，以厚壁菌門為主，包括粗糞桿菌、真桿菌、糞球菌以及羅斯伯里亞屬，由丁酸激酶或乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)。雙歧桿菌的基因組含有碳水化物物水解酶，參與乙酸和乳酸的生物合成。然而，也有實(shí)驗(yàn)表明雙歧桿菌生產(chǎn)SCFAs的能力高度依賴基因含量的多樣性。粘性阿克曼氏菌是一種可以誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子分泌和增強(qiáng)腸道黏膜屏障的有益細(xì)菌，該菌可以通過粘蛋白降解產(chǎn)生SCFAs。

短鏈脂肪酸控制著人體腸腔內(nèi)的PH，是一種重要的原料，與人類健康和疾病直接相關(guān)。腸道產(chǎn)生丁酸可以改善口服葡糖糖耐量試驗(yàn)后的胰島素反應(yīng)，而丙酸產(chǎn)生或吸收異常會(huì)增加患T2D的風(fēng)險(xiǎn)。SCFAs在人類生理過程中發(fā)揮重要作用的機(jī)制可能是它們?cè)诩せ钣坞x脂肪酸受體(FFARs、FFAR2和FFAR3)、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs、GPR109A和GPR42)、嗅覺受體(ORs、OR51E1和OR51E2)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)和芳基烴受體(AhR)方面的信號(hào)傳遞能力。這些受體被乙酸、丙酸和丁酸激活后，可進(jìn)一步導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括磷脂酶C(PLC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酶A2(PLA2)和核因子-κB(NF-κB)通路。這些通路在飽腹感調(diào)節(jié)、能量獲取、脂肪存儲(chǔ)、脂肪炎癥以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要功能，因此SCFAs可以引起各種復(fù)雜疾病。此外，細(xì)胞內(nèi)的SCFAs還可以影響組蛋白(主要是3和4)的乙?；腿ヒ阴；?主要是賴氨酸殘基N端的ε氨基酸上)，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。這一過程主要是通過抑制組蛋白去乙?；?HDACs)的活性導(dǎo)致更多具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)，或增加組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)的活性，從而激活乙?；磻?yīng)。HDACs和一系列復(fù)雜疾病都相關(guān)，包括結(jié)腸直腸癌和阿爾茨海默病。丁酸、丙酸和乙酸對(duì)HDACs都有抑制作用，其中丁酸的抑制作用最強(qiáng)。因此，腸道內(nèi)的短鏈脂肪酸是引起人類復(fù)雜疾病的重要機(jī)制之一。

氨基酸(AAs)可以由腸道微生物通過消化食物蛋白質(zhì)產(chǎn)生或通過從頭合成。重要的是，所有9種必需氨基酸(組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)都可以由腸道微生物通過草酰乙酸/天冬氨酸合成基因合成。研究表明，操縱微生物基因組，比如產(chǎn)孢梭菌的fldC可以改變?nèi)祟愌褐蟹枷阕灏被岬暮?。除了作為蛋白質(zhì)合成和SCFAs發(fā)酵的底物外，AAs的缺乏也與人類疾病相關(guān)。其中，色氨酸是化學(xué)性質(zhì)最復(fù)雜的氨基酸，對(duì)與宿主和微生物的代謝途徑都有影響。色氨酸脫羧酶可以誘導(dǎo)色氨酸轉(zhuǎn)化為色氨胺及其衍生物，許多細(xì)菌基因組中都含有該基因，包括乳酸菌屬、消化鏈球菌屬、擬桿菌屬及雙歧桿菌屬。下游的代謝物可以被宿主不同的腸道受體感知，從而參與調(diào)節(jié)不同的代謝途徑。這些受體包括GPR35、AhR、5-羥色胺受體(5-HT4R和5-HT3R、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活劑1α(PGC-1α)和孕烷X受體(PXR)，與大腦、骨骼肌、胰腺和腎臟疾病相關(guān)。組氨酸可以通過激活p38γ-p62-mTORC1通路來影響T2D中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。苯丙氨酸與帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，可以從多巴胺衍生。賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸則來源于草酰乙酸/天冬氨酸生物合成途徑，該途徑可以通過線粒體sirtuin4(SIRT4)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶25(STK25)參與胰島素分泌和葡萄糖代謝。此外，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是與胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良相關(guān)的支鏈氨基酸(BCAAs)，然而，其背后的機(jī)制尚不清楚。

毒素類可以由腸道微生物從多種底物合成，包括氨基酸和膽堿類化合物?？梢院偷鞍踪|(zhì)結(jié)合的尿毒素如TMAO、吲哚、對(duì)甲酚、苯酚及其硫酸鹽、葡萄糖醛酸酯、多胺以及馬尿酸都是由腸道微生物從氨基酸中衍生的。TMAO及其衍生物主要由編碼膽堿TMA裂解酶（cutC/D）、肉堿單加氧酶、甜菜堿還原酶和TMAO還原酶的微生物基因合成。氨基酸衍生出的尿毒癥毒素如吲哚、對(duì)甲酚和苯酚的產(chǎn)生在很大程度上取決于不同菌群的基因含量。例如，編碼色氨酸酶的基因在擬桿菌屬中不盡相同，因此，只有部分?jǐn)M桿菌屬的菌種可以產(chǎn)生硫酸吲哚酚。這些毒素可以通過NF-κB、MAPK和JunN-端激酶途徑進(jìn)一步誘導(dǎo)慢性腎病(CKD)和CVD，從而啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子和粘附分子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。從膽堿類化合物中衍生的毒素主要包括TMAO及其衍生物，其在CVD中具有多種作用，可以通過MAPK和NF-κB信號(hào)以及NLRP3炎癥小體發(fā)揮作用，導(dǎo)致炎癥。此外，革蘭氏陰性菌（主要是擬桿菌）可以合成毒素脂多糖(LPS)，通過NF-κB途徑影響CAD的發(fā)生。

維生素是人類必須的營(yíng)養(yǎng)素，且只能從食物和腸道微生物等外源性物質(zhì)中獲取。腸道微生物主要合成維生素K和大部分水溶性B族維生素，如如生物素(H)、鈷胺素（B12）、葉酸（B9）、煙酸（B3）、泛酸（B5）、吡哆醇（B6）、核黃素（B2）和硫胺素（B1），產(chǎn)生這些維生素的細(xì)菌可以占腸道微生物的40%-65%。近年來，逐漸有研究報(bào)導(dǎo)微生物在B族維生素生物合成中的作用。據(jù)估計(jì)，人類每日所需的維生素K一半都是由腸道微生物（如擬桿菌、雙歧桿菌和腸球菌）提供的。值得注意的是，合成維生素K和水溶性B族維生素的酶在不同菌中有所不同。因?yàn)槟睾凸氢}蛋白合成都需要維生素K，因此其在凝血和骨骼生成中起著關(guān)鍵作用。此外，維生素K可以通過激活Gla蛋白來調(diào)節(jié)NF-κB/Nrf2通路，從而影響T2D中的血管炎癥。此外，B族維生素還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。例如，HCS-sGC-PKG通路調(diào)節(jié)生物素合成，Nrf2調(diào)節(jié)吡哆醇、鈷胺素和泛酸合成，BDR4結(jié)合亞甲基四氫葉酸脫氫酶、環(huán)水解酶和甲酰四氫葉酸合成酶1(MTHFD1)等調(diào)節(jié)葉酸合成，GPR109調(diào)節(jié)尼克酸合成，DNA甲基化影響核黃素，p53影響硫胺素合成等。

膽汁酸(BAs)是由肝臟中的膽固醇合成的兩親性類固醇，一般稱為初級(jí)膽汁酸。初級(jí)膽汁酸在小腸內(nèi)被重吸收，結(jié)腸中的微生物對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，形成次級(jí)膽汁酸。這一過程主要由7α/β-去羥基化酶介導(dǎo)。最近一項(xiàng)研究表明微生物的基因組結(jié)構(gòu)變異與人類血漿膽汁酸相關(guān)，但這些結(jié)構(gòu)變異的功能大部分仍然是未知的。結(jié)構(gòu)變異(SVs)發(fā)生在細(xì)菌基因組上的高度可變區(qū)域，由于近來宏基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，鑒定到的SV主要包括存在/缺失變異和拷貝數(shù)變異。在過去的幾十年中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了BAs許多重要功能，比如膽汁形成、促進(jìn)腸道脂質(zhì)和脂溶性維生素的吸收、維持膽固醇穩(wěn)態(tài)以及在小腸中發(fā)揮抗菌作用。此外，已經(jīng)證明BAs可以起到激素的作用，參與調(diào)控葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝，調(diào)節(jié)免疫功能和細(xì)胞增殖，控制解毒反應(yīng)等。BAs參與的反應(yīng)主要通過激活核受體介導(dǎo)，即法尼類X受體(FXR)、維生素D受體(VDR)、PXR、雄烷受體(CAR)以及膜結(jié)合受體，如武田G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)和鞘氨醇-1-磷酸受體2(S1PR2)。重要的是，不同類型的初級(jí)和次級(jí)BAs由于結(jié)構(gòu)不同，在經(jīng)典功能和信號(hào)通路中發(fā)揮的作用不盡相同。這似乎是具有生理學(xué)意義的，因?yàn)樵诤芏嗳巳宏?duì)列研究中都發(fā)現(xiàn)了不同個(gè)體間血漿BA濃度和組成的顯著差異與肝臟脂肪含量、脂肪肝疾病、T2D以及多種血脂參數(shù)相關(guān)。

花青素是一類含有酚類結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，廣泛分布于植物液泡中，其顏色具有PH依賴性?；ㄇ嗨匾蚱錆撛诘慕】狄嫣幎蝗耸熘梢灶A(yù)防各種疾病，包括心血管疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病，以及改善視覺和大腦功能。天然存在與食物中的常見花青素有花葵素、矢車菊素、花翠素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵花素等。值得注意的是，花青素的益生元效應(yīng)依賴微生物的調(diào)節(jié)。例如，腸道微生物分解矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）產(chǎn)生酚類化合物，包括原兒茶酸、香草酸、間苯二醛和阿魏酸，從而激活Nrf2 、MAPK和NF-κB通路影響腸道中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。微生物代謝花青素的產(chǎn)物鞣酸(GA)可以通過增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化來增加一氧化氮(NO)的水平。GA還抑制血管緊張素- I轉(zhuǎn)換酶(ACE)，降低血壓。

植物雌激素是植物的非甾體次生代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特的雙酚類結(jié)構(gòu)，包括多種類別的化合物，如二苯乙烯、香豆雌酚、異黃酮、鞣花丹寧和木酚素。植物雌激素廣泛存在于我們的日常飲食中，具有各種物理化學(xué)和生物作用，包括抗氧化、抗菌、消炎、抗癌和保護(hù)心臟。與花青素相似，植物雌激素更傾向與雌激素受體結(jié)合。然而，通過腸道微生物酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化的植物雌激素變體生物活性顯著增強(qiáng)。腸道微生物可以將植物雌激素轉(zhuǎn)化為其他分子，如雌馬酚、腸內(nèi)酯和腸二醇。雌馬酚可與在大腦多個(gè)區(qū)域都表達(dá)的核雌激素受體(ERs)結(jié)合，促進(jìn)小腦發(fā)育。腸內(nèi)酯和腸二醇都能緩解被脂多糖激活的外周血淋巴細(xì)胞的作用，進(jìn)而導(dǎo)致抑制性-κB (I-κB)的降解和NF-κB的激活，從而產(chǎn)生TNF-α。

圖2：影響人類健康的腸道微生物代謝物

腸道微生物參與了一系列具有生物活性的代謝物合成和轉(zhuǎn)化，這些代謝物可以作為底物和信號(hào)分子，參與人類生理功能或者誘發(fā)復(fù)雜疾病。微生物相關(guān)代謝分子主要包括短鏈脂肪酸(SCFAs)、氨基酸(AAs)、維生素、膽汁酸(BAs)、毒素、花青素以及植物學(xué)雌激素等

藥物互作

腸道微生物可以通過與藥物的雙向互作影響人類健康和疾病（圖3）。一方面，許多腸道細(xì)菌在維持宿主代謝健康中發(fā)揮重要作用，抗生素可以通過一系列機(jī)制殺死這些細(xì)菌。例如，青霉素可以攻擊細(xì)菌細(xì)胞壁阻止其合成肽聚糖，而肽聚糖是細(xì)菌在人體內(nèi)存活所需的細(xì)胞壁強(qiáng)度主要來源。喹諾酮類藥物通過靶向結(jié)合DNA螺旋酶（這種酶能夠解開DNA雙鏈進(jìn)行復(fù)制）以防止細(xì)菌的增殖。四環(huán)素阻止關(guān)鍵分子結(jié)合到核糖體上的特定位點(diǎn)，從而阻止無性生殖?？菇Y(jié)核病的抗生素屬于利福平類，都是通過抑制RNA的合成來發(fā)揮作用。

相反，常用的非抗生素藥物也可受腸道微生物的影響，通過酶促反應(yīng)改變其利用度、生物活性或毒性。最近一項(xiàng)體外試驗(yàn)，評(píng)估了來自人類腸道的76株細(xì)菌菌株(代表了主要細(xì)菌分類群中的68種)代謝271種藥物的能力。這些藥物是根據(jù)分子結(jié)構(gòu)或?qū)ι眢w的影響等因素選擇的。研究顯示，有176種藥物能夠被至少一種菌株引起代謝變化，從而導(dǎo)致藥物種活性分子水平的降低。這些結(jié)果都表明了大部分藥物都能被微生物修飾/代謝，因此，通過對(duì)個(gè)體腸菌進(jìn)行分離并測(cè)試其對(duì)藥物的滅活作用將有助于推動(dòng)個(gè)性化選藥。

圖3：微生物與藥物的相互作用

腸道微生物可以通過與藥物的雙向互作影響人類健康和疾病。一方面，許多腸道細(xì)菌在維持宿主代謝健康中發(fā)揮重要作用，抗生素可以通過一系列機(jī)制殺死這些細(xì)菌。另一方面，常用的非抗生素藥物可受腸道微生物的影響，通過酶促反應(yīng)改變其利用度、生物活性或毒性

表征微生物功能的工具

基于下一代高通量測(cè)序技術(shù)，人們開發(fā)了一系列生物信息學(xué)工具來解碼微生物DNA序列并預(yù)測(cè)其功能。一般來說，這些工具根據(jù)其原理可以分為三類，即基于分類標(biāo)記基因的間接預(yù)測(cè)、基于基因同源性的直接預(yù)測(cè)和基于序列相似性的從頭預(yù)測(cè)。

基于分類標(biāo)記基因的間接預(yù)測(cè)

基于擴(kuò)增子的標(biāo)記基因(如16S rRNA)測(cè)序是評(píng)估和比較樣本內(nèi)或樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的有力工具。然而，由于這種技術(shù)序列信息僅來自特定的基因組區(qū)域，因此對(duì)腸道微生物功能的了解有限。不過，研究人員通?？梢詮囊雅囵B(yǎng)的物種中推斷出未培養(yǎng)物種的功能，因?yàn)槲挥谝粋€(gè)進(jìn)化支的物種攜帶相同的核心基因。因此，一個(gè)物種基因組編碼的功能可以基于相鄰物種和注釋良好的基因組而被部分預(yù)測(cè)。基于這個(gè)理論，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了基于分類信息學(xué)的腸道微生物組功能組分分析工具PICRUSt2、Tax4Fun2、BugBase和Piphillin等（表1）。

PICRUSt2利用一種基于IMG的擴(kuò)展祖先狀態(tài)重建算法對(duì)現(xiàn)有基因家族進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后通過加權(quán)法對(duì)這些基因家族進(jìn)行組合，從而估計(jì)宏基因組的組成。Tax4Fun2依賴Ref100NR對(duì)最近鄰居進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)一步通過歸一化和線性組合生成KEGG結(jié)果。Piphillin使用全局最近鄰匹配算法生成獨(dú)立于任何提議系統(tǒng)發(fā)育樹的OTU豐度表，進(jìn)一步結(jié)合最新的KEGG來分析功能組分。BugBase基于先驗(yàn)知識(shí)及系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，通過16S預(yù)測(cè)微生物表型(如耐氧量、革蘭氏染色和致病潛能)。上述工具的預(yù)測(cè)能力主要依賴于可獲得的基因組的功能信息，最近在基于宏基因組組裝的基因組構(gòu)建方面的進(jìn)展則會(huì)大大提高功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

表1：基于分類標(biāo)記基因預(yù)測(cè)工具總結(jié)

基于同源基因的直接預(yù)測(cè)

和基于分類標(biāo)記基因的間接預(yù)測(cè)相比，鳥槍宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(MGS)產(chǎn)生的大量測(cè)序reads能夠覆蓋整個(gè)基因組，這些reads通過和注釋良好的數(shù)據(jù)庫直接比對(duì)即可對(duì)腸道微生物功能進(jìn)行更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)。基于MGS進(jìn)行功能預(yù)測(cè)的工具主要包括HUMAnN3 、MEGAN 、ShotMAP和 gutSMASH（表2）。HUMAnN3基于UniRef生成物種水平的基因豐度，并進(jìn)一步將其分配到MetaCyc通路。MEGAN基于SEED、eggNOG和KEGG來描述微生物功能。ShotMAP將reads預(yù)測(cè)為開放閱讀框(ORFs)，進(jìn)一步搜索SFams蛋白家族數(shù)據(jù)庫。GutSMASH基于KnownClusterBlast和ClusterBlast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類解析，挖掘重要的代謝基因簇，這些基因簇負(fù)責(zé)人體腸道微生物中各種代謝產(chǎn)物的生物合成。

表2：基于同源基因預(yù)測(cè)工具總結(jié)

基于序列的從頭預(yù)測(cè)

目前的微生物基因組注釋方法都是基于序列相似性原理，與已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，比如UniRef、MetaCyc、SEED、eggNOG和KEGG。目前為止，只有接近60%的微生物基因組可以通過基于同源基因方法被注釋，接近一半的微生物功能仍然是未解之謎。此外，因?yàn)閺念^突變(單核苷酸變異， SNVs)導(dǎo)致的遺傳多樣性迅速增加，而遺傳多樣性可以調(diào)控基因表達(dá)和功能。值得注意的是，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的一個(gè)普遍觀點(diǎn)是一段基因序列定義了基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，而這個(gè)結(jié)構(gòu)反過來又決定了一個(gè)特定的功能。換句話說，即使兩個(gè)基因序列相似性高達(dá)99%，但由于剩下1%的變異引起的結(jié)構(gòu)差異，它們的功能也可能完全不同。因此，基于最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)(如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu))來預(yù)測(cè)微生物基因的功能是一種很有前景的方法。最近，已經(jīng)開發(fā)出一款機(jī)器學(xué)習(xí)的方法AlphaFold，在不知道蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)的情況下，其預(yù)測(cè)也能達(dá)到原子級(jí)別的精度。AlphaFold融合了有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理和生物學(xué)知識(shí)，并將多序列比對(duì)設(shè)計(jì)在深度學(xué)習(xí)算法中。它沒有強(qiáng)加已知的蛋白質(zhì)生物物理學(xué)規(guī)則在其中，也沒有模擬蛋白質(zhì)折疊的物理過程。相反，AlphaFold從多次預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的嘗試中不斷學(xué)習(xí)改進(jìn)。因此，它可能會(huì)以一種全新的方式席卷微生物功能預(yù)測(cè)領(lǐng)域。

然而，在利用鳥槍法宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)來解碼物種水平的微生物功能之前，還有很關(guān)鍵的一步是要對(duì)短reads的進(jìn)行分箱。分箱基于是否依賴參考基因組主要分為兩類。基于參考數(shù)據(jù)的方法是使用bowtie2等工具直接將reads比對(duì)到已有的微生物數(shù)據(jù)庫，因此它的主要缺點(diǎn)是無法識(shí)別未知微生物基因組。不依賴參考數(shù)據(jù)的方法是一種無監(jiān)督的方法，在沒有任何參考數(shù)據(jù)庫下將重疊群直接分箱。近年來，人們也評(píng)估了宏基因組分箱的各種工具，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因組分箱工具雖然在獨(dú)特菌株上表現(xiàn)良好，但在重構(gòu)常見菌株上，所有基因組分箱工具仍然還面臨重大挑戰(zhàn)。這可能是因?yàn)檫@些常見的菌株具有相似的基因組，不易區(qū)分。盡管如此，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的發(fā)展將極大幫助從頭分箱。

驗(yàn)證微生物功能的技術(shù)

在計(jì)算機(jī)方面，已經(jīng)通過關(guān)聯(lián)理論確定了數(shù)百種可能對(duì)人類健康與疾病產(chǎn)生影響的微生物。然而，對(duì)關(guān)注的腸道微生物進(jìn)行預(yù)測(cè)的功能缺乏驗(yàn)證。因此，利用最先進(jìn)的技術(shù)，如培養(yǎng)組學(xué)、基因編輯、新的研究模型以及多組學(xué)技術(shù)，可以進(jìn)一步加強(qiáng)我們對(duì)其功能的理解，并開發(fā)完全基于腸道微生物組的個(gè)性化藥物（圖4）。

圖4：利用先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行微生物功能驗(yàn)證

在人類隊(duì)列研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腸道微生物與各種疾病有關(guān)。雖然可以通過各種生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)腸道微生物的潛在功能，但缺乏功能驗(yàn)證。因此，利用最先進(jìn)的技術(shù)，如培養(yǎng)組學(xué)、基因編輯、新的研究模型以及多組學(xué)技術(shù)，可以進(jìn)一步加強(qiáng)我們對(duì)其功能的理解，并開發(fā)基于腸道微生物的個(gè)性化藥物

培養(yǎng)組學(xué)

對(duì)腸道微生物組的測(cè)序表明，腸道中的大多數(shù)細(xì)菌仍未經(jīng)過培養(yǎng)，揭示了特定腸道微生物功能的重要性。然而，該技術(shù)可能與DNA提取程序、生信工具、以及少數(shù)微生物種群的偏倚相關(guān)。因此，研究人員開發(fā)出培養(yǎng)組學(xué)來培養(yǎng)和鑒定人類腸道中的未知細(xì)菌，從而進(jìn)行直接的功能驗(yàn)證和臨床應(yīng)用。培養(yǎng)組學(xué)是一種利用多種培養(yǎng)條件、質(zhì)譜和測(cè)序來鑒定細(xì)菌種類的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)組學(xué)的第一步是提供多種培養(yǎng)條件，促進(jìn)分離自人類腸道的細(xì)菌生長(zhǎng)。促進(jìn)這些少數(shù)菌種的生長(zhǎng)主要得益于培養(yǎng)基的改良。接下來，利用質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定微生物種類，該技術(shù)主要是分離蛋白質(zhì)譜與最新的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。在此之后，利用16S和全基因組測(cè)序，通過和從人類身上恢復(fù)的微生物基因組進(jìn)行比較來確認(rèn)新的分類群。利用培養(yǎng)組學(xué)已經(jīng)分離出數(shù)千種細(xì)菌菌株，其中很大一部分都被認(rèn)為是新的物種/菌株。這些都允許我們?cè)跈C(jī)制研究中，結(jié)合體外和動(dòng)物模型或臨床應(yīng)用(如微生物群移植和CRISPR-Cas9基因組編輯)，直接驗(yàn)證關(guān)聯(lián)理論所作的功能假設(shè)。

基因編輯

研究表明，腸道微生物基因組中普遍存在結(jié)構(gòu)變異。此外，基于全局宏基因組樣本的SNP水平系統(tǒng)發(fā)育分析表明，物種間存在顯著的遺傳變異。在同一微生物菌株基因組中的變異可能導(dǎo)致其功能上有所不同。為了了解基因組變異的作用，可以利用CRISPR-Cas9等基因編輯工具修改微生物分離株的基因組，從而研究微生物的功能遺傳調(diào)控機(jī)制。

人源化動(dòng)物模型和類器官芯片模型

由于倫理問題，人類不能直接參與到腸道微生物在人類健康與疾病中功能的驗(yàn)證試驗(yàn)中。因此，新的體內(nèi)和體外模型涌現(xiàn)出來，如人源化動(dòng)物模型和類器官芯片技術(shù)，成為下一代研究疾病和藥物模型。人性化動(dòng)物模型是通過編輯動(dòng)物基因組或誘導(dǎo)外部變化而獲得的具有類人表型的動(dòng)物模型。例如，通過CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)敲掉Cyp2c70基因，可獲得一個(gè)具有人類膽汁酸含量的小鼠模型，從而更好地揭示腸道微生物對(duì)BA代謝和CVD的影響。在器官芯片模型中，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以分化獲得不同的組織和細(xì)胞類型。特別是像腸道芯片和肝臟芯片這樣的模型對(duì)于研究微生物-腸道和宿主-微生物的相互代謝作用是非常有意義的。

多組學(xué)技術(shù)

除了通過基因組來研究微生物的功能，還可以通過生成各種類型的組學(xué)數(shù)據(jù)集，如代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，進(jìn)一步將它們從分類關(guān)聯(lián)到潛在功能都與腸道微生物組聯(lián)系起來，加強(qiáng)我們對(duì)腸道微生物在復(fù)雜疾病中重要性的理解。然而，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展仍有很大挑戰(zhàn)，阻礙了對(duì)腸道微生物功能的進(jìn)一步探索。傳統(tǒng)的靶向方法可以精確地識(shí)別和定量單個(gè)代謝產(chǎn)物或蛋白質(zhì)，但其通量較低且成本較高，不太適用于大型隊(duì)列研究。通過對(duì)MS-MS進(jìn)行改進(jìn)，非靶向方法可以在單次注射后分析數(shù)千個(gè)分子，然而，功能注釋和量化仍然是這種方法的瓶頸。盡管在十多年前就發(fā)布了代謝物鑒定的公共指南，但一直沒有一個(gè)推薦的標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)有效的解決方法就是為特定的代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)種類制定有針對(duì)性的提取/鑒定方案。此外，對(duì)酶功能的理解也在加深我們對(duì)未知代謝物和蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)。代謝反應(yīng)的知識(shí)將促進(jìn)更強(qiáng)大識(shí)別工具的發(fā)展。對(duì)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，一個(gè)主要挑戰(zhàn)就是微生物RNA的分離，因?yàn)榧S便樣本比較復(fù)雜，很難獲得高質(zhì)量的微生物RNA。然而，單細(xì)菌測(cè)序技術(shù)的發(fā)展可能是一個(gè)更好的解決方案。

未來展望

目前，微生物組的研究主要集中在微生物類群和功能基因豐度方面。但依靠測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的腸道微生物豐度并不能真正反映人類腸道中微生物的真實(shí)密度(絕對(duì)豐度)。如果樣品之間微生物的負(fù)荷差異很大，相對(duì)分析將會(huì)阻礙微生物組特征與定量數(shù)據(jù)(如代謝物濃度)之間的關(guān)聯(lián)。因此，近年來出現(xiàn)了利用流式細(xì)胞儀將微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后與糞便微生物組測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合的微生物組定量分析方法，該方法在評(píng)估個(gè)體內(nèi)部和個(gè)體之間的微生物變化方面有更大的潛力。然而，缺點(diǎn)是該方法取決于實(shí)驗(yàn)技巧，且單一的測(cè)量并不能很好地估計(jì)平衡豐度。此外，該方法非常昂貴且耗時(shí)，并不適用于大隊(duì)列研究。因此，該技術(shù)還有很大的進(jìn)步空間。

除了非常重要的微生物基因拷貝數(shù)變異之外，研究腸道微生物基因組的變異也是一個(gè)重要的方向。與人類基因組一樣，微生物DNA序列中的SNPs、SV(如插入和缺失)、移動(dòng)遺傳元件(如噬菌體和轉(zhuǎn)座元件)對(duì)微生物功能也至關(guān)重要，并與人類疾病相關(guān)。在過去的幾十年里，微生物功能的遺傳調(diào)控研究主要集中在有限的已知基因上。多組學(xué)技術(shù)可將生理測(cè)量或代謝物濃度與微生物全基因組系統(tǒng)關(guān)聯(lián)(例如，SNPs和sv)，揭示腸道微生物在宿主健康和疾病中的新功能，且其分辨率比微生物豐度高得多，然而，相關(guān)的研究極其缺乏。然而，在生物信息學(xué)(如在上述章節(jié)中討論過的基因組分箱問題)和統(tǒng)計(jì)學(xué)(例如，微生物基因組中數(shù)百萬個(gè)SNP增加了統(tǒng)計(jì)測(cè)試的數(shù)量，這將對(duì)檢測(cè)能力產(chǎn)生負(fù)面影響)方面仍存在許多挑戰(zhàn)。在不久的將來，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序和常見變異研究可能是一個(gè)潛在的探索方向。

結(jié)  論

腸道菌群對(duì)宿主的影響主要是通過微生物毒力因子、代謝分子以及與藥物的雙向互作來介導(dǎo)的。我們歸納了腸道微生物在人類健康和疾病中的潛在功能，并總結(jié)了相關(guān)的分子機(jī)制。此外，我們還介紹了相關(guān)的生物信息學(xué)工具，可以用于解碼微生物基因組的功能，研究人員可以根據(jù)其特定目的去使用它們。最后，我們介紹了培養(yǎng)組學(xué)、基因組編輯、多組學(xué)技術(shù)以及功能驗(yàn)證新模型的重要性，并闡述了通過調(diào)節(jié)腸道微生物來改善人類健康的可能性。