【原】多標(biāo)實(shí)驗(yàn)的10大實(shí)驗(yàn)技巧

優(yōu)寧維 2022-09-02 發(fā)布于上海

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多重免疫分析具有許多優(yōu)點(diǎn)，如可以從每個(gè)樣本中獲取更多的生物信息，更高的通量以及（在許多情況下）降低成本。多標(biāo)實(shí)驗(yàn)還通過在相同的實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)測(cè)量所有分析物來消除其他變量的影響，例如測(cè)定溫度，緩沖液系統(tǒng)和操作員。開發(fā)多重免疫測(cè)定的主要挑戰(zhàn)是不同分析物的濃度和表達(dá)模式可能會(huì)有很大差異。這可以通過仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來解決。

1. 了解樣本信息
為了使多重免疫測(cè)定生成可靠的數(shù)據(jù)，必須對(duì)其進(jìn)行配置以確保準(zhǔn)確檢測(cè)所討論的每種分析物。分析物的豐度和表達(dá)位置可能不同；雖然有些分析物是細(xì)胞內(nèi)的，但其他分析物在細(xì)胞表面表達(dá)或作為分泌的生物分子表達(dá)。在某些情況下，可能需要刺激分析物表達(dá)（例如，通過與生長(zhǎng)因子一起孵育）或鑒定特定的蛋白質(zhì)亞型。UniProt和PAXdb等開放獲取資源提供有關(guān)蛋白質(zhì)豐度，已知異構(gòu)體和翻譯后修飾（PTM）的信息，而出版物和抗體數(shù)據(jù)表是其他有用的資源。

2. 考慮所需的多路復(fù)用級(jí)別
多重免疫測(cè)定的復(fù)雜性范圍很廣，包括靶蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)和同一膜上的上樣物對(duì)照，通過對(duì)組織切片中3或4種不同蛋白質(zhì)的免疫組化（IHC）分析，到基于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)由單個(gè)細(xì)胞表達(dá)的多達(dá)20種不同的分析物。使用基于磁珠的檢測(cè)或抗體陣列，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)百個(gè)生物分子。作為一般規(guī)則，對(duì)特定分析物的了解越少，所需的多重檢測(cè)水平就越高;雖然檢測(cè)盡可能多的靶標(biāo)可能很誘人，但分析物的數(shù)量應(yīng)與每次測(cè)試的成本以及測(cè)定開發(fā)和驗(yàn)證所涉及的工作量相平衡。

3. 鑒定合適的分析物特異性抗體
分析物特異性抗體是多重免疫測(cè)定的關(guān)鍵成分，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇。首先，應(yīng)針對(duì)預(yù)期應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，抗體制造商的數(shù)據(jù)表為抗體性能提供支持證據(jù)。同樣重要的是需要滴定抗體以鑒定可接受的信號(hào)窗口;這包括分析物特異性抗體和將用于檢測(cè)的任何二抗。單克隆抗體具有批次間性能一致和保證長(zhǎng)期供應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。然而，由于多克隆可以通過識(shí)別幾種表位來提供信號(hào)放大，因此它們可以成為檢測(cè)稀有分析物的首選。通常的做法是在同一實(shí)驗(yàn)中將單克隆和多克隆抗體組合在一起以進(jìn)行多重檢測(cè)。

4. 選擇兼容的二抗
除非可與酶或熒光團(tuán)偶聯(lián)分析物特異性抗體，否則二抗是實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測(cè)的必需試劑。重要的是，二抗可以提供信號(hào)擴(kuò)增，這意味著它們通常被納入多重免疫測(cè)定工作流程中，以確保檢測(cè)低豐度靶標(biāo)。在選擇二抗試劑時(shí)，確認(rèn)它們與分析物特異性抗體相容至關(guān)重要 - 例如，山羊抗兔二級(jí)試劑將用于檢測(cè)在兔宿主中培養(yǎng)的分析物特異性抗體。亞類特異性二抗提供了并行使用來自同一宿主物種的幾種抗體的靈活性，前提是它們的特異性已得到制造商的確認(rèn)，而交叉吸附的二抗（Min X）可最大限度地減少物種交叉反應(yīng)性，這可能是不需要的背景信號(hào)的來源。當(dāng)其他一抗選項(xiàng)不可用時(shí)，也有標(biāo)記來自同一宿主物種的兩種一抗的策略。

5. 確定是否需要額外的信號(hào)放大
雖然多克隆分析物特異性抗體和二抗試劑都提供信號(hào)擴(kuò)增，但有時(shí)可能需要進(jìn)一步增強(qiáng)測(cè)定信號(hào)。一種流行的方法是使用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素（LSAB）信號(hào)擴(kuò)增，即在加入標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)之前，分析物特異性抗體被生物素化的二抗結(jié)合。在這種情況下，信號(hào)放大是通過1）多個(gè)生物素附著在每個(gè)二抗上和2）鏈霉親和素的四聚體性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，其每個(gè)分子具有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，增加了親和力。

6.使用在線工具
在大多數(shù)情況下，多重免疫測(cè)定依賴于熒光讀數(shù)（免疫印跡是一個(gè)例外，其中化學(xué)發(fā)光檢測(cè)可用于同時(shí)可視化具有不同分子量的兩個(gè)條帶），并且建議將明亮的熒光團(tuán)與稀有靶標(biāo)配對(duì)，反之亦然。隨著靶標(biāo)分析物數(shù)量的增加，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變得越來越具有挑戰(zhàn)性，特別是對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，在同一實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)到多達(dá)20種不同的生物分子。 Spectra Viewer等在線工具通過提供熒光團(tuán)激發(fā)和發(fā)射光譜的可視化來簡(jiǎn)化面板設(shè)計(jì)，從而快速評(píng)估熒光團(tuán)兼容性。

7. 記得確認(rèn)批次間的一致性
多重免疫測(cè)定涉及使用廣泛的抗體選擇，隨著時(shí)間的推移，每種抗體將包含不同的批次。建議研究人員在每次購買新批次時(shí)測(cè)試抗體性能 - 包括分析物特異性抗體和二抗試劑 - 以確?？芍貜?fù)的結(jié)果。對(duì)于涉及大量樣品的研究，或那些將在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的研究，直接從制造商處購買（或保留）大量抗體試劑可能是明智的。

8. 始終包括適當(dāng)?shù)目刂?/span>
質(zhì)控品對(duì)于任何免疫測(cè)定都是必不可少的，它們用于監(jiān)測(cè)測(cè)定性能和驗(yàn)證結(jié)果。陽性對(duì)照產(chǎn)生最大的測(cè)定信號(hào)，而陰性對(duì)照提供非特異性結(jié)合的指示;兩者都應(yīng)包含在每個(gè)免疫測(cè)定中，無論檢測(cè)到的不同靶標(biāo)的數(shù)量如何。其他類型的對(duì)照包括僅二抗對(duì)照，旨在評(píng)估在沒有分析物特異性抗體的情況下的二抗結(jié)合;補(bǔ)償對(duì)照，用于通過用單個(gè)熒光團(tuán)染色樣品來評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)中的光譜重疊;和同種型對(duì)照（包含與分析物特異性抗體具有相同同種型和濃度但不能識(shí)別靶標(biāo)的抗體），用于 IHC 和流式細(xì)胞術(shù)，以幫助識(shí)別背景染色的來源。

9. 考慮整合自動(dòng)化
自動(dòng)化通過提高樣品通量和提高實(shí)驗(yàn)一致性來補(bǔ)充多路復(fù)用的優(yōu)勢(shì)。它還降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，有助于防止對(duì)身體的重復(fù)性勞損，并釋放研究人員的時(shí)間用于其他任務(wù)。自動(dòng)化選項(xiàng)包括可同時(shí)分配96個(gè)等分試樣的多通道分配器，IHC染色系統(tǒng)和全自動(dòng)免疫測(cè)定平臺(tái);這些都是值得考慮的，作為簡(jiǎn)化多路復(fù)用工作流程的策略。

10.使用高品質(zhì)二抗產(chǎn)品
進(jìn)行多標(biāo)記免疫測(cè)定可能讓人無從下手，但Jackson ImmunoResearch（一家為生命科學(xué)應(yīng)用提供二抗的專業(yè)原始生產(chǎn)商）可以為您提供幫助。JIR公司提供與熒光蛋白（包括 R-PE、APC 和 PerCP）和熒光染料（包括 Alexa Fluor?、亮紫色和羅丹明紅?）偶聯(lián)的二抗，以及亞類特異性二抗、交叉吸附二抗、生物素化二抗、并標(biāo)記鏈霉親和素。

關(guān)于JacksonImmunoresearch
Jackson ImmunoResearch Inc.是美國著名的二抗生產(chǎn)商。30年的專注，30年的發(fā)展，JIR公司除了提供各種酶標(biāo)（如鼠兔酶標(biāo)二抗）及熒光二抗（Alexa Fluor系列，Cy3/Cy5,PE等熒光標(biāo)記），種類豐富，涉及物種齊全，標(biāo)記多樣，應(yīng)用（WB/IF/IHC/FC）廣泛，性價(jià)比高。