果子嘮嗑：

上周感謝高師姐給我手把手做了免疫熒光，有了國(guó)手級(jí)別的朋友在身邊，人就容易膨脹，最終有了不大不小的發(fā)現(xiàn)。
好在我現(xiàn)在年紀(jì)偏大，比較穩(wěn)重，看到重要結(jié)果的時(shí)候不再大驚小怪，反倒是謹(jǐn)慎又謹(jǐn)慎，反復(fù)地質(zhì)疑，總覺得這么好的事情怎么可能降落在我身上。
然后我們就順勢(shì)談到發(fā)nature的事情，不是單篇，而是背靠背，我感到無比膨脹，跟臨床醫(yī)學(xué)生互稱教授一樣，就當(dāng)一笑，2019年一定要盡量克制，多做事情，少談夢(mèng)想。
以下是高師姐對(duì)自己2018年以及免疫熒光這個(gè)系列的總結(jié)。
其中久別重逢那一節(jié)十分精彩。

今天是新年的第一天，早上賴了個(gè)床，順便在床上思考了過去的一年干了些什么。

準(zhǔn)備回國(guó)

感覺過去的一年就像打仗一樣，記得18年新年的時(shí)候去德華叔家吃了開年第一餐，然后去美嬌姐姐家、小南瓜那里蹭了很多次飯。去素素家，去三寶阿姨家，去蕭伯伯家吃離別的飯，各個(gè)朋友的送別飯。實(shí)驗(yàn)室各種補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，各種道別。最后的那一兩個(gè)月，特別高產(chǎn)，數(shù)據(jù)蹭蹭蹭的出來。然后就到了離別的時(shí)候，也是各種趕，在紐約的JFK機(jī)場(chǎng)扔巧克力的畫面也歷歷在目，總之感覺就是兵荒馬亂。

久別重逢

終于順利回國(guó)，順便去上?？戳死嫌岩约靶陆坏哪杏?果子：此處的男友應(yīng)當(dāng)是男性朋友，新交的男友，是極具想象空間的文字，以后請(qǐng)注意正確使用)，那天的上海還是很漂亮的，記得有陽(yáng)光。然后回重慶，當(dāng)時(shí)感覺T3航站樓好遠(yuǎn)啊，總之走了很久很久才到拿行李的地方。順利拿上行李后，一走出去就看到剛哥傻兮兮的在那里望著我笑(果子：剛哥現(xiàn)在是高師姐的老公)，當(dāng)時(shí)覺得春天來了(果子：這種文字現(xiàn)在很少見)。剛接到我時(shí)，他都不敢牽我的手，后來狡辯說是因?yàn)榭吹轿议L(zhǎng)胖了，不想牽?，F(xiàn)在想起來內(nèi)心還是暖洋洋的。

有得有失

然后就是匆匆的見了導(dǎo)師，回家倒時(shí)差，回重慶，扯證，呆在實(shí)驗(yàn)室，然后又是各種適應(yīng)，各種面對(duì)突發(fā)狀況。博士延期，寫文章，整理課題，感覺特別的忙，但是又感覺沒有任何的輸入。有一小段時(shí)間特別沮喪，最后還好，順利渡過。在2018年還是學(xué)到許多新東西，半學(xué)會(huì)了游泳，學(xué)會(huì)了用ImagJ及PS換假彩，學(xué)習(xí)了一些思考問題的方式方法，然后好像就沒有更多了。

2018，有收獲，順利結(jié)束單身生活，開始適應(yīng)生命中有另外一個(gè)人；開始學(xué)會(huì)承擔(dān)自己的責(zé)任和應(yīng)盡的義務(wù)；順利去了正陽(yáng)門下；從很多老師那里獲得了他們的想法與知識(shí)。2018，有遺憾，沒有把游泳學(xué)完，沒有好好鍛煉身體，畢業(yè)相關(guān)文章沒有順利發(fā)出?？傊?018年還是比較美好的一年。2019年呢，希望畢業(yè)相關(guān)文章順利發(fā)出，順利畢業(yè)，順利工作，有屬于自己的生活，平安，喜樂。

哈哈哈，看到這里的都是真愛啊，謝謝你們聽我嘮嘮叨叨半天。

今天主要分型我做免疫熒光遇到的問題及解決辦法。
我們也是按步驟一步步來講。

細(xì)胞鋪板密度

上周和果子老師做了一次免疫熒光。我們按我常做的密度鋪板，發(fā)現(xiàn)第二天細(xì)胞就非常滿了，說明細(xì)胞在不同的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的。所以建議大家在做細(xì)胞鋪板時(shí)，自己要根據(jù)別人的建議摸一個(gè)最適的濃度。原則就是細(xì)胞一定是單層生長(zhǎng)，不要太密。最后可以有單個(gè)細(xì)胞的存在。細(xì)胞只有呈單層并且健康生長(zhǎng)時(shí)，結(jié)果才是比較可信的。因?yàn)榧?xì)胞密集以后，細(xì)胞會(huì)抑制生長(zhǎng)，有些促進(jìn)凋亡的蛋白就會(huì)增加，細(xì)胞的周期也會(huì)比較靠后，對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響還是比較大的。

每個(gè)人鋪板的手法不一致，所以有的人的板子是周圍細(xì)胞多，有的人的板子是中間細(xì)胞多。這些情況都是有很多因素引起，這里只講你滴入細(xì)胞后的處理。你在加入細(xì)胞后，需要均勻的晃動(dòng)板子，可以呈8字形，也可以十字交叉。最好加入后放置水平臺(tái)上2-3分鐘，輕輕放進(jìn)孵箱，保證它的平整。

細(xì)胞固定

細(xì)胞固定之前需要清洗細(xì)胞，這里需要注意，如果是自己配置的PBS，那一定要調(diào)PH并且過濾（0.44um）。這里清洗細(xì)胞建議用冰的PBS。

• 貼壁細(xì)胞，如果細(xì)胞比較好貼壁，需要邊洗邊拍。如果細(xì)胞貼壁不緊，那就要小心了。

• 懸浮細(xì)胞，是相反的，需要邊洗邊離心。

這里要說的是選用固定劑要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)具體而定，固定時(shí)間不宜太長(zhǎng)。固定液最好也用0.44um的濾器過濾一下。

細(xì)胞通透

如果你選用的是皂苷進(jìn)行通透，需要注意細(xì)胞膜的可逆性通透，也就是孵育每個(gè)抗體都需要通透，并且皂苷通透無法到核膜。另外細(xì)胞還可用冰甲醇同時(shí)進(jìn)行固定和通透，這樣的話可以避免去垢劑的使用，但是細(xì)胞的自發(fā)熒光會(huì)強(qiáng)一些。建議組織的免疫熒光不要用此固定。

細(xì)胞封閉

上兩次帖子中有人問說為什么不能用BSA封閉。我在此進(jìn)行說明，我是建議在有條件的情況下盡量不要用BSA封閉?？梢赃x擇免疫熒光專用封閉液。

一抗

• 抗體的特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景及定位不佳的問題。在正常情況下，純化的抗體效果會(huì)更好一些。這里需要強(qiáng)調(diào)，在你不知你的抗體性質(zhì)及蛋白情況下，需要設(shè)立正確的對(duì)照。如果有陽(yáng)性對(duì)照一定要設(shè)，而對(duì)于陰性對(duì)照，就是使用只有二抗染色的片子，這樣有利于減少降低背景干擾。

• 合適的抗體稀釋比例

通常免疫熒光抗體的稀釋是1ug/mL的純化抗體足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果?？贵w濃度過高時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性（因?yàn)椴祭蔬\(yùn)動(dòng)）。所以再第一次使用抗體時(shí)或測(cè)定抗原時(shí)，建議做濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

在前面的帖子，有老師提到說，他們?cè)谛∈笊砩锨萌胍粋€(gè)帶flag標(biāo)簽蛋白時(shí)，（因?yàn)榇说鞍兹鄙倏贵w，所以后續(xù)檢測(cè)都是用的Flag）做組織免疫熒光時(shí)，WB可以檢測(cè)到表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)不到。不知道大家有沒有相同的經(jīng)歷，或者大家認(rèn)為什么原因?qū)е铝诉@種情況的出現(xiàn)。我在這里先說幾種我知道的原因，在排除方法學(xué)錯(cuò)誤的情況下：

• WB Flag的抗體不適用于IFA；

• 組織自發(fā)熒光較強(qiáng)，二抗選用綠熒光；

• Flag所接的蛋白分子量較大，抗原暴露不好。

如果大家還有其他的想法，歡迎留言討論。

我沒有遇到過上面的情況，我倒是遇到過以下幾種情況：

• 只有蛋白全長(zhǎng)免疫產(chǎn)生的抗體才可做免疫熒光，而多肽免疫的沒有辦法做。

之前做一個(gè)胞內(nèi)寄生菌的時(shí)候，做出來一個(gè)小GTP蛋白與我的細(xì)菌有共定位，但是查閱文獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)所有的報(bào)道都是說沒有共定位。后來筆者導(dǎo)師發(fā)現(xiàn)我們所用抗體時(shí)全長(zhǎng)蛋白免疫的，然后我們買回市面上所有和這個(gè)蛋白相關(guān)的抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有全長(zhǎng)的才可以。后來問了專門做蛋白和抗體的老師，他們的解釋是多肽有時(shí)候抗原表位的識(shí)別位點(diǎn)不是蛋白所作用的位點(diǎn)，活性蛋白時(shí)有可能將此位點(diǎn)包裹。

• 免疫熒光檢測(cè)得到，而WB檢測(cè)不到

我自己包括上周果子老師的IFA時(shí)都遇到，WB檢測(cè)不出，IFA可以檢測(cè)出。這個(gè)應(yīng)該可以理解，如果你這個(gè)蛋白的表達(dá)豐度比較低時(shí)，WB往往檢測(cè)不到。

二抗

二抗的選擇也是很重要的。如果做得是免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，那么二抗盡量選擇預(yù)吸附的，并且進(jìn)行單染實(shí)驗(yàn)。如果是二重或者多重染色，那就必須選擇預(yù)吸附的了，且二抗的種屬來源盡量一致。

封片

注意不要有氣泡。片子要烤干

降低背景

背景高常常會(huì)是免疫熒光會(huì)遇到的問題。所以每一步都要小心。首先我會(huì)用二抗來源的血清代替BSA封閉，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。

好了，今天就到這里，在新的一年里祝大家新年快樂。