 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)作為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一,結(jié)合高特異性單克隆抗體，為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和醫(yī)療帶來了許多具有重大意義的突破， 該技術(shù)也成為了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)科研工作者極為青睞的一種分析手段，越來越多的科研文章中出現(xiàn)流式數(shù)據(jù)的身影。  不過，由于流式細(xì)胞儀比較稀缺，一般實(shí)操機(jī)會較少，加上流式實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，要拿到一個(gè)好的流式結(jié)果還是不太容易的。 這里小P根據(jù)研發(fā)部門經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合流式細(xì)胞儀工作原理，整理了幾個(gè)流式實(shí)驗(yàn)最需要注意的幾個(gè)點(diǎn)，希望對你們有所幫助~ 流式細(xì)胞儀工作原理 流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)C）是一門基于流式細(xì)胞儀發(fā)展而來的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 流式細(xì)胞儀主要是由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)構(gòu)成（部分機(jī)型還包含細(xì)胞分選系統(tǒng)）。 其中液流系統(tǒng)的作用是讓細(xì)胞能夠單列排列依次通過光信號檢測點(diǎn)，是光路系統(tǒng)發(fā)揮作用的基礎(chǔ)；光路系統(tǒng)始于激光器發(fā)射器，發(fā)射不同波長激光照射到細(xì)胞后，產(chǎn)生的光信號（散射光信號和熒光信號）會經(jīng)過不同光學(xué)濾片傳輸?shù)讲煌ǖ捞綔y器；電子系統(tǒng)負(fù)責(zé)將接受到的光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電子信號并進(jìn)行分析，從混合細(xì)胞群中鑒別出不同的亞群；而具有分選功能的流式細(xì)胞儀則還能從大量細(xì)胞中分選出感興趣的亞群進(jìn)行更多研究。 因此通過流式細(xì)胞儀，我們可以對液體中的懸浮細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析和分選。 （左：液流系統(tǒng)；右：光路系統(tǒng)） 流式細(xì)胞術(shù)注意事項(xiàng) ★ 樣本制備階段： 1. 樣品要新鮮采集，注意樣本Fc受體封閉 流式實(shí)驗(yàn)所用樣本，不管是獨(dú)立細(xì)胞樣本（懸浮細(xì)胞、外周血、體液等），還是實(shí)體臟器樣本，最好均為新鮮采集的樣本，因?yàn)殡S著時(shí)間推移，樣本細(xì)胞會發(fā)生形態(tài)改變、抗原表達(dá)下降等現(xiàn)象。 并且值得注意的是，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC 細(xì)胞、粒細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞等，會表達(dá) Fc 受體，與抗體的Fc段發(fā)生非特異結(jié)合，造成雜信號，此時(shí)我們需要對樣本進(jìn)行封閉，消除非特異性信號。 一般情況下，我們可以采用抗CD16和抗CD32單克隆抗體進(jìn)行封閉，因?yàn)镃D16和CD32是IgG Fc段的受體。 2. 針對不同蛋白，采取不同固定和通透方法 細(xì)胞內(nèi)蛋白在染色時(shí)，應(yīng)該針對不同性質(zhì)蛋白（細(xì)胞表面蛋白、胞內(nèi)蛋白、分泌蛋白、核蛋白等），采取不同的固定和通透方法，以使抗體能接近蛋白靶標(biāo)。 細(xì)胞表面蛋白可直接標(biāo)記；胞內(nèi)蛋白和核蛋白均需固定、破膜后再標(biāo)記；針對分泌蛋白，則需要Monensin或者BFA預(yù)處理，破壞Na+、H+梯度，阻斷高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，使分泌蛋白滯留胞內(nèi)。 ★ 樣本標(biāo)記階段： 1. 抗體選擇 流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件：靶標(biāo)特異性，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)(流式實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)C)。 流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2. 熒光染料選擇 關(guān)于熒光染料，我們首選需要根據(jù)流式細(xì)胞儀來篩選合適波長熒光素，適配儀器激發(fā)光和濾光片： 其次，熒光染料發(fā)光亮度有強(qiáng)弱差別，常用熒光的強(qiáng)弱如下：PE > APC > Alexa Flour 647 > PE-Cy7 > PerCP-Cy5.5 > Alexa Flour 488 > FITC > APC-Cy7。 多色搭配時(shí)，我們需要根據(jù)靶標(biāo)性質(zhì)（表達(dá)強(qiáng)弱）挑選熒光素，亮度高熒光素用于低表達(dá)蛋白，亮度較弱熒光素用于高表達(dá)蛋白。 并且，多色搭配時(shí)，熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小，如FITC/APC： ★ 實(shí)驗(yàn)對照選擇：
好啦~ 以上就是今天想和大家分享的全部內(nèi)容， 感興趣的小伙伴可以收藏哈~ 注：針對流式細(xì)胞術(shù)更多實(shí)驗(yàn)技巧以及流式產(chǎn)品推薦，小P這邊有整理一份《Proteintech流式抗體產(chǎn)品目錄和技術(shù)指南》手冊，公眾號回復(fù)“流式”即可獲取下載鏈接~有需要的自取哈~ — — — — END — — — — |
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