2021年10月28日，來自加拿大多倫多大學的Philip M Kim課題組在J Med Chem上發(fā)表了題為“Computational Design of PotentD-Peptide Inhibitors of SARS-CoV-2” 的文章，該研究通過理性設計方法設計了可以抑制SARS-CoV-2感染的新型D肽抑制劑。
由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)病毒引起的COVID-19已成為全球性的流行病，感染可導致發(fā)燒、嚴重呼吸道疾病和肺炎。研究表明，與SARS-CoV類似，SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結(jié)合域可以與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體結(jié)合，侵染人體細胞。因此阻斷其相互作用是一種有效的治療策略。目前許多針對SARS-CoV-2的RBD的中和抗體正在開發(fā)中，作為COVID-19的有效療法。然而，由于抗體分子量大，生產(chǎn)成本高，應用受到了一定限制。此外，David Baker組還設計了與新冠病毒刺突蛋白緊密結(jié)合的小型蛋白，然而宿主對這些蛋白質(zhì)的蛋白水解活性或免疫反應可能會限制它們的治療或預防應用。由D-氨基酸組成的多肽具有獨特的優(yōu)勢，包括低免疫原性、低制造成本和蛋白水解穩(wěn)定性，因此病毒D肽抑制劑的開發(fā)具有很大的應用價值。在這項工作中，作者成功設計了兩種SARS-CoV-2 RBD的高親和力D肽結(jié)合劑。作者的設計策略是以ACE2與病毒刺突蛋白RBD結(jié)合界面的螺旋為模板，對PDB的鏡像數(shù)據(jù)庫（D-PDB）進行檢索，尋找匹配度最好的序列模擬ACE2結(jié)合螺旋。首先作者分析了ACE2與RBD結(jié)合界面的熱點殘基，使用 Elastic2 服務器通過丙氨酸突變掃描方法(CAS)進行預測，結(jié)果表明，殘基Q24、K31、D38、Y41、K353、D355和R357對于ACE2 結(jié)合RBD影響比較大，其中殘基Q24、K31、D38和Y41位于ACE2結(jié)合螺旋內(nèi)，而K353、D355和R357位于發(fā)夾環(huán)內(nèi)（圖1A）。作者使用兩種ACE2三維結(jié)構(gòu)（PDB：6vw1和6m17）作為設計新型D肽抑制劑的模板，接下來將ACE2結(jié)合螺旋分成兩個片段，分別表示為helix1和helix2，對D-PDB數(shù)據(jù)庫進行檢索，匹配結(jié)果是通過查詢結(jié)構(gòu)中的特定原子與D-PDB中的匹配結(jié)構(gòu)之間的rmsd來衡量的，最終找到了匹配度最好的序列（圖1B），通過添加兩個（DAla-DAla）將其連接成Covid1、Covid2、Covid3和Covid4四個D型多肽（表1）。圖1 SARS-CoV-2 刺突蛋白RBD 的新型 D-肽結(jié)合劑的設計策略表1 SARS-CoV-2 Spike RBD D-肽結(jié)合劑的設計序列 
接下來作者通過200 ns的MD模擬評估了刺突蛋白與D型多肽復合物的穩(wěn)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3和4具有最穩(wěn)定的結(jié)合模式，之前的一項計算設計研究表明，將發(fā)夾環(huán)L351-R357接到多肽結(jié)構(gòu)上，可能會增加α-螺旋肽與刺突蛋白結(jié)合親和力。因此作者將多肽結(jié)構(gòu)疊加到ACE2-RBD復合物結(jié)構(gòu)上分析其可行性，Covid3的N端區(qū)域與發(fā)夾環(huán)之間觀察到的沖突表明將發(fā)夾環(huán)RI序列添加到該肽結(jié)構(gòu)中是不合適的。而Covid4可以通過添加RI序列來增加其親和力，命名為Covid_extended_1（圖2）。圖2 SARS-CoV-2 RBD與D-肽復合物3D結(jié)構(gòu)模型后續(xù)作者選取Covid3、Covid4、Covid_extended_1測試其與RBD的結(jié)合親和力，生物層干涉測量(BLI)實驗結(jié)果表明三種肽都可以結(jié)合RBD，但親和力不同。動力學擬合發(fā)現(xiàn)Covid extended_1與RBD結(jié)合的親和力最高 (29 ± 0.25 nM)，其次是Covid3 (31 ± 0.25 nM)，Covid4的結(jié)合親和力最弱 (105 ± 0.17 nM) （圖3）。圖3 BLI 檢測D-肽與RBD 的結(jié)合親和力最后，作者研究了Covid3和Covid_extended_1抑制SARS-CoV-2感染Vero細胞的能力，Covid_extended_1和Covid3均對SARS-CoV-2感染具有抑制作用，IC50分別為 5.76 ± 2.14 μM 和 6.56 ± 1.65 μM （圖4）。
圖4 新型D-肽抑制SARS-CoV-2感染 Vero細胞由于新型冠狀病毒的傳播過程中伴隨著很多突變株的產(chǎn)生，比如英國（N501Y、A570D、D614G和P681H）、南非（K417N、E484K、N501Y和D614G）、巴西（K417T、E484K、N501Y和D614G）和日本（K417N、E484K、N501Y和D614G）突變株，作者對這些突變位點進行分析發(fā)現(xiàn)K417T、K417N、N501Y位于復合物結(jié)合界面上。因此接下來作者研究Covid3和Covid_extended_1是否對SARS-CoV-2突變株具有抑制作用，選取了英國突變株B.1.1.7和南非突變株B.1.351進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Covid_extended_1和Covid3均可以抑制突變株B.1.1.7的感染，IC50分別為 5.57 ± 4.04 和 33.40 ± 10.75 μM。對于突變株 B.1.351，Covid_extended_1和Covid3分別以 7.37 ± 1.80 和 11.13 ± 3.82 μM的IC50抑制了其感染（圖5）。其中Covid_extended_1對于突變株的抑制作用明顯好于Covid3。
圖5 新型D-肽抑制SARS-CoV-2突變株感染 Vero細胞在這篇文章中，作者設計了有效的新型D肽抑制劑，通過搜索PDB的鏡像版本來模擬ACE2 α1 結(jié)合螺旋。成功設計出兩條D肽分別以29和31nM的親和力結(jié)合RBD，并可以阻斷SARS-CoV-2對Vero細胞的感染，IC50分別為5.76和6.56μM。除此之外，這兩種D肽抑制劑以相似的效力中和了兩種受關注突變株B.1.1.7和B.1.351的感染。新型D肽抑制劑的研發(fā)將有助于后續(xù)SARS-CoV-2的預防和治療。Valiente PA, KimPM，et al. Computational Design of Potent D-Peptide Inhibitors of SARS-CoV-2. J Med Chem. 2021 Oct28;64(20):14955-14967.doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00655.
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