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技術領域： 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，特別涉及一種防止草莓組織培養(yǎng)過程中褐變的培養(yǎng)基及利用其組培繁育草莓苗的方法。 背景技術： 草莓是薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界七大水果之一，營養(yǎng)豐富，有“水果皇后”的美稱。另外食用草莓對腸胃病和貧血病有一定的療效，對促進智力發(fā)育有重要作用。深受國內(nèi)外消費者的喜愛。草莓是一種栽培周期短、結果早、見效快的經(jīng)濟作物，但是草莓的病毒害嚴重影 響草莓的生產(chǎn)。作為高級漿果的草莓，在我國目前的生產(chǎn)栽培上多沿用無性繁殖種苗主要方法是匍匐莖繁殖和分株繁殖，但這兩種方法效率低、種苗易退化、易造成病毒蔓延。王國平(1988)等調(diào)查，我國栽培草莓帶病毒植株率過80%以上，戴子林(1995)等調(diào)查，我國長江流域感染大面積植株感染率在50%以上，感染了病毒病的草莓結果會存在變小、畸形、品質(zhì)差、生長緩慢等問題，一般減產(chǎn)30%-80%，并逐年加重；嚴重影響草莓的長勢、品質(zhì)和產(chǎn)量，對病毒病目前還沒有藥劑可以防治。目前，解決草莓病毒病的主要方法是通過草莓脫毒組培技術來擴繁草莓脫毒苗，使草莓種苗回復品種的優(yōu)良性狀以達到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的目的。目前，常見草莓外植體組織培養(yǎng)類型包括草莓莖尖組織培養(yǎng)、草莓葉片和葉柄組織培養(yǎng)、草莓莖段組織培養(yǎng)、草莓花藥培養(yǎng)。草莓組織培養(yǎng)程序一般可分為外植體準備、苗誘導、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移植馴化等幾個階段，其中在每個階段的培養(yǎng)基選用、溫室條件等對組培苗的繁育系數(shù)、脫毒效果、再生率等關鍵參數(shù)有著重要影響。其中MS培養(yǎng)基是草莓組培過程中最常用的培養(yǎng)基，即Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設計的具備較高無機鹽和離子濃度的穩(wěn)定培養(yǎng)基，其硝酸鹽含量高、養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長，是目前被廣泛應用于植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基本培養(yǎng)基。但是，在草莓組織培養(yǎng)中，褐變是影響初代培養(yǎng)褐化和限制初代培養(yǎng)再生率的重要原因，即外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過程中，由于切割造成機械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應產(chǎn)生有色物質(zhì)而導致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制細胞內(nèi)其它酶的活性，影響細胞的正常代謝，毒害整個組織，甚至導致組織死亡。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?01010252871. 4)公開了一套草莓莖尖組培專用的初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基以及用該系列培養(yǎng)基培養(yǎng)草莓莖尖組織生產(chǎn)脫毒苗的方法。其所述的初代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并在其中添加濃度為O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)，并在初代培養(yǎng)時進行暗培養(yǎng)預防褐化，但其防止褐變的主要手段還是在于減少光照以抑制PPO的活性，防止多酚類物質(zhì)的氧化，從而減少被培養(yǎng)的組織褐變。但這種技術手段下初代培養(yǎng)的成活率僅從普通的40%左右提升到50-65%，還有提升的空間。王棟等在《植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施》(黑龍江農(nóng)業(yè)科學2008(1)7 10)中分析了植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐變的若干因素，并公開了利用吸附劑(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化劑(抗壞血酸、硫代硫酸鈉、檸檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇、酪氨酸、巰基乙醇、卵清蛋白、維生素B、維生素E、有機酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、亞硫氫酸鈉、氰化鉀、多胺)等用來減少植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象。其主要原理在于通過吸附組織培養(yǎng)過程中由于切割造成機械損傷處分泌的酚類化合物，或者通過上述抗氧化劑防止擴散到培養(yǎng)基中的酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質(zhì)，從而達到防止褐變的作用。但是，這種方法的不足之處在于只能被動解決擴散到培養(yǎng)基質(zhì)中的酚類化合物，在實際生產(chǎn)過程中還是會存在較高的褐變現(xiàn)象 發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明的目的在于提供一種相對于現(xiàn)有防褐變技術能更有效預防草莓組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用初代培養(yǎng)基。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種再生率高的組培草莓苗生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術方案是一種能有效預防草莓組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用初代培養(yǎng)基，以O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并在其中添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)，其中pH值保持在5. 7-5. 8 ； 上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為8-12 mg/L,油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O. 05-0. 3 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基還可以包含有O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和 O.3mg/L的激動素(KT)； 上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的口引哚乙酸(IAA)來代替。本發(fā)明的生產(chǎn)方法的技術方案是一種再生率高的組培草莓苗生產(chǎn)方法，其步驟包括1、取材。每年的6-8月，選擇植株生長健壯，匍匐莖充實，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良植株取其莖尖或花藥，作為組織培養(yǎng)的外植體。2、消毒。材料取來修整后用紗布包好放在自來水龍頭下沖洗2-4小時(以莖尖為例)，然后進行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分鐘，然后用O. 1%的新潔爾滅浸泡15-20分鐘，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分鐘，最后用1-2%的過氧乙酸消毒I分鐘。每次都要用無菌水沖洗3-4次后再進行下一次消毒。整個消毒過程都應在超凈工作臺內(nèi)完成。3、接種。接種在超凈工作臺內(nèi)進行，接種前要先用酒精燈對接種用具(鑷子、接種針、接種架等)消毒自然放涼。先用鑷子一層層的剝?nèi)デo尖外的幼葉和鱗片，然后在解剖鏡下找到生長點(可帶1-2個葉原基)用接種針挑出生長點(小于O. 5毫米)，放入盛有上述草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，封好瓶口，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株。 4、室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)室要求干凈清潔，室內(nèi)裝有紫外線殺菌燈，每天要對室內(nèi)進行消毒，以防污染。培養(yǎng)溫度20-28°C，最適溫度25°C，相對濕度70%，光照強度1000-2000勒克斯，每日光照10小時左右。5、繼代培養(yǎng)。每培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)瓶內(nèi)的小植株就會分出3_5個小植株，把這些小植株分出放于由含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基組成的繼代培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；過20-30天后又會長出小植株，如此反復進行繼代培養(yǎng)，增加繁殖系數(shù)。6、誘導生根。根據(jù)生產(chǎn)需要可在1-2月份集中一批苗子生根。草莓試管苗生根很容易，有的在繼代培養(yǎng)基上便可生根。或者在培養(yǎng)基中加入O. 5毫克/升的LBAj^ 30天左右便可長出6-10條長約2-3厘米的小根。7、溫室馴化。把生好根的小苗經(jīng)光照鍛煉7-10天，從試管內(nèi)取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽入土質(zhì)疏松的沙土摻入少量有機質(zhì)的營養(yǎng)土內(nèi)，移栽后要澆透水，支小拱棚覆蓋塑 料薄膜保濕。馴化溫度以15-20°C，前兩周空氣相對濕度80-100%，第三周開始短時間放風，放風強度逐漸加大，至移栽后第四周可去掉覆蓋物。根據(jù)情況每天或隔天噴水一次，保持土壤濕潤而不積水為宜。時間為2-3個月以小苗發(fā)出5-6片新葉為宜。8、病毒鑒定和檢驗。利用電子顯微鏡檢測草莓病毒，即利用負染色法及超薄切片法處理待測葉片，然后在電子顯微鏡下觀察，如果被測葉片中含有較多病毒顆粒子，可被直接觀察到。經(jīng)檢驗確認無毒的草莓苗移入網(wǎng)紗大棚進行繁殖。9、網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖。草莓病毒的傳播主要靠蚜蟲、飛虱等蟲媒傳播。把無病毒苗放入網(wǎng)紗內(nèi)繁殖可防止蚜蟲等傳播病毒。網(wǎng)紗大棚內(nèi)土壤要經(jīng)過嚴格消毒，并注意定期噴施殺蚜蟲藥，網(wǎng)紗大棚內(nèi)育苗與苗圃育苗大體一致。本發(fā)明的有益效果在于1、利用本發(fā)明提供的初代培養(yǎng)基，即以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，再添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯而組成的初代培養(yǎng)基，在進行初代培育過程中，其中的抗壞血酸和油菜素內(nèi)酯可以發(fā)揮防褐變方面的協(xié)同作用，一方面通過發(fā)揮抗壞血酸對滲入到培養(yǎng)基中酚類物質(zhì)的抗氧化作用體現(xiàn)直接還原作用，另一方面油菜素內(nèi)酯在外植體內(nèi)部能增強草莓組織內(nèi)部抗氧化酶的活性，減少褐變根本因素醌類物質(zhì)的產(chǎn)生和擴展；兩者的結合能有效防止草莓初代培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生，將褐變率從常規(guī)的30%以上降低到20%以下。2、褐變率的降低和初代培養(yǎng)草莓組織中的抗氧化情況的改善，萌發(fā)率從40-60%提升至70%以上。 具體實施例方式實施例 在6-8月選擇植株生長健壯，匍匐莖充實，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良草莓植株取其莖尖組織培養(yǎng)的外植體。將莖尖組織修整后用紗布包好放在自來水龍頭下沖洗2-4小時，然后進行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分鐘，然后用O. 1%的新潔爾滅浸泡15-20分鐘，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分鐘，最后用1-2%的過氧乙酸消毒I分鐘。每次都要用無菌水沖洗3-4次后再進行下一次消毒。整個消毒過程都應在超凈工作臺內(nèi)完成。 對接種用具(鑷子、接種針、接種架等)消毒自然放涼后用鑷子一層層的剝?nèi)デo尖外的幼葉和鱗片，然后在解剖鏡下找到生長點(可帶1-2個葉原基)用接種針挑出生長點(小于0.5毫米)，放入盛有不同激素配比的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，封好瓶口，培養(yǎng)溫度20-28°C，最適溫度25°C，相對濕度70%，光照強度1000-2000勒克斯，每日光照10小時左右，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株。在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度激素和配方組成的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的具體組成和初代培養(yǎng)效果如下表所示 權利要求 1.一種草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其特征在于還含有濃度為5_15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)。 2.根據(jù)權利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的基本培養(yǎng)基還可以含有濃度為O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和O. 3mg/L的激動素(KT)。 3.根據(jù)權利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)來代替。 4.根據(jù)權利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的基本培養(yǎng)基的pH控制在5. 7-5.8。 5.根據(jù)權利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為8-12 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O. 05-0. 3 mg/L。 6.根據(jù)權利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。 7.—種生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于其步驟包括，(1)取材；每年的6-8月，選擇植株生長健壯，匍匐莖充實，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良植株取其莖尖或花藥，作為組織培養(yǎng)的外植體；(2)消毒;(3)配制草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，完成接種后封好瓶口，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株；所述草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還含有濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)；(4)室內(nèi)培養(yǎng)和繼代培育；當培養(yǎng)瓶內(nèi)的小植株分出3-5個小植株時，把這些小植株分出放于含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基組成的繼代培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)并反復進行繼代培養(yǎng)；(5)溫室馴化及病毒鑒定；把生好根的小苗經(jīng)光照鍛煉7-10天后移栽入土質(zhì)疏松的沙土摻入少量有機質(zhì)的營養(yǎng)土內(nèi)，進行馴化并利用電子顯微鏡檢測草莓病毒；(6)網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖；將網(wǎng)紗大棚內(nèi)土壤嚴格消毒后，把無病毒苗放入網(wǎng)紗內(nèi)繁殖。 8.根據(jù)權利要求7所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述步驟(2)消毒中， 采用70%酒精、O. 1%的新潔爾滅、O. 1%的升汞(氯化汞)、1-2%的過氧乙酸等對植物組織進行消毒。 9.根據(jù)權利要求7所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述步驟(4)室內(nèi)培養(yǎng)和繼代培育中，其室內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度20-28°C，相對濕度70%，光照強度1000-2000勒克斯，每日光照10小時左右。 10.根據(jù)權利要求9所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述室內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度的最適溫度為25V。 全文摘要 本發(fā)明公開了一種草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基。其以含有0.2-0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并加入了濃度為5-15mg/L的抗壞血酸(VC)和0.001-0.5mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)，可大幅度降低草莓組織初代培養(yǎng)過程中的褐變率并提高萌發(fā)率。本發(fā)明還公開了利用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)草莓莖尖組織生產(chǎn)組培草莓苗的方法，包括草莓苗的取材、消毒、接種和初代培育、繼代培養(yǎng)、馴化及病毒鑒定、網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖等步驟。本發(fā)明能有效防止草莓初代培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生，初代培養(yǎng)草莓組織中的抗氧化情況有效改善，萌發(fā)率從40-60%提升至70%以上。 文檔編號A01H4/00GK102986534SQ201210540779 公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權日2012年12月14日 發(fā)明者畢德 申請人:蘇州和美生物科技有限公司 |
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