蛋白質(zhì)芯片的制備技術(shù)與核酸芯片類似，主要包括基質(zhì)材料的選擇和處理、探針的選擇以及把探針排布到基質(zhì)材料上的方法。

蛋白質(zhì)芯片的基質(zhì)材料可以選擇聚丙烯酰胺膠、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纖維素膜、載玻片、硅片、紙、PDMS和金等。根據(jù)所選擇的基質(zhì)材料的不同，應(yīng)采用不同的方式對(duì)基質(zhì)材料進(jìn)行預(yù)處理。固定蛋白分子的方式包括吸附、共價(jià)鍵合、分子自組裝等。

意大利Bologna大學(xué)的Roda等人使用HP51629A型打印機(jī)的噴墨頭直接用熱噴印法將蛋白質(zhì)溶液分配到紙上以制造蛋白質(zhì)陣列。其中使用的蛋白質(zhì)溶液是1mg/mL的辣根過氧化物酶(HRP)溶液（溶解于0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液中，pH8.6)，并加入了SDS降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力以達(dá)到原先使用的墨水的表面張力值。他們先后試驗(yàn)了纖維素紙、纖維素濾膜、尼龍膜、照相用白凝膠紙和噴墨透明薄膜，發(fā)現(xiàn)只有纖維素紙的效果較好，酶和纖維素紙的結(jié)合方式可能是物理吸附。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明抗體IgG和IgM也可以使用這種方法噴印到纖維素紙上，并且保持蛋白質(zhì)活性。

美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室和俄羅斯恩格爾哈得分子生物學(xué)研究所的科學(xué)家們所研制的生物芯片稱為MAGIC(micro array of gel immobilized compounds)芯片，這一類生物芯片的基質(zhì)材料采用的是聚丙烯酰胺膠。膠具有熒光背景低、易于修飾各種化學(xué)基團(tuán)、吸附量大的優(yōu)點(diǎn)。其中蛋白質(zhì)芯片所使用的聚丙烯酰胺膠的配方為3%的丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺，3：1)、40%的甘油，0.002%的亞甲基藍(lán)、0.012%的TEMED，用0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液配制，pH為7.0。膠配制好以后，用戊二醛含量為5%的PB緩沖液(27mmol/L KCl，14mmol/L KH2PO4，43mmol/L Na2HPO4，pH7.4)室溫下活化48小時(shí)。再將4ug/uL的蛋白質(zhì)溶液（溶解于PBS緩沖液中）用機(jī)械手排布到膠上，20℃溫育24小時(shí)，以使得蛋白質(zhì)上的氨基和經(jīng)戊二醛活化的膠上的醛基之間形成酰胺鍵，從而達(dá)到固定蛋白質(zhì)的目的。

德國Max-Plank分子遺傳學(xué)研究所的Bussow等人所研制的蛋白質(zhì)芯片的基質(zhì)材料為聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。這種膜在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中很常用，可以吸附蛋白質(zhì)分子。他們將構(gòu)建的人胎腦cDNA文庫轉(zhuǎn)入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，再將篩選到的克隆直接原位破胞后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。英國的分子生物學(xué)MRC實(shí)驗(yàn)室和蛋白質(zhì)工程MRC實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家所使用的方法和Bussow等人的相似，但是使用的是硝酸纖維素膜。

載玻片也可以作為蛋白質(zhì)芯片的基質(zhì)材料，但是要事先經(jīng)過一定的化學(xué)處理。美國的Genometrix公司的Mendoza等人采用的載玻片處理方法是先用化學(xué)試劑氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)(5%的乙醇溶液)浸泡潔凈的載玻片10分鐘，進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，再用化學(xué)試劑進(jìn)行進(jìn)一步的處理，從而便于與蛋白質(zhì)結(jié)合。Harvard大學(xué)的MaBeath采用的則是另外一種方法，他們直接采用了美國TeleChem公司的SuperAldehyde載玻片。這種玻片是表面帶有醛基修飾的載玻片。蛋白質(zhì)N端的氨基或是其中賴氨酸所帶的氨基可以和載玻片表面的醛基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成希夫(Schiff)堿結(jié)構(gòu)。也可以先在潔凈的載玻片表面覆蓋一層BSA分子，再用化學(xué)試劑對(duì)BSA進(jìn)行活化。這樣BSA中被活化的賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和谷氨酸(Glu)殘基可以和點(diǎn)到載玻片上的蛋白質(zhì)發(fā)生氨基偶聯(lián)或是形成脲的結(jié)構(gòu)。但是這種共價(jià)連接方式可能會(huì)使得固定于載玻片表面的蛋白質(zhì)不能保持原始的穩(wěn)定構(gòu)象，從而失活。而研究表明，由于蛋白質(zhì)分子與載玻片表面的連接總是通過少數(shù)幾個(gè)這樣的共價(jià)鍵形式實(shí)現(xiàn)的，反而有利于蛋白質(zhì)以各種可能的方式展現(xiàn)在載玻片的表面。2001年，美國耶魯大學(xué)的Synder實(shí)驗(yàn)室的Zhu等人制作的世界首張酵母全蛋白組芯片也是使用載玻片為芯片的基底。他們使用高效表達(dá)載體表達(dá)并且純化出大約5800種酵母的蛋白，由于表達(dá)出的蛋白質(zhì)都帶有His tag，所以他們?cè)诓Ｆ砻媸褂肗i2+進(jìn)行修飾，通過親和吸附固定蛋白質(zhì)分子。

1996年美國Colorado大學(xué)物理系的Mooney等人在硅片上通過光化學(xué)光刻的方法實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子的固定。硅片的表面先經(jīng)過一定處理形成一層二氧化硅，然后加人試劑n-十八烷基三甲氧基硅烷(n-octadecyltrime-thoxysilane：OTMS)，使其在二氧化硅的表面自組裝為單分子層。然后利用掩模對(duì)硅片表面進(jìn)行光刻，去掉一部分OTMS。這時(shí)加入BSA，OTMS表面可以吸附一層BSA分子，但是去除了OTMS的二氧化硅表面基本不吸附BSA(吸附程度不足OTMS表面吸附程度的2%)。這樣在BSA上可以組裝上鏈霉親和素(streptavidin)，再結(jié)合上相應(yīng)的生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)達(dá)到固定化的目的。

蛋白質(zhì)芯片的基質(zhì)材料也可以用金。在表面化學(xué)研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)金可以和各種生物分子結(jié)合。德國的Interactiva公司研制的蛋白質(zhì)生物芯片XNA on Gold就以金作為芯片的基底。他們?cè)谳d片上先制作一層100nm厚的金膜，然后在金膜上自組裝一層長鏈的硫醇烴。在硫醇烴的一端連接上鏈霉親和素分子，這樣，生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子就可以組裝在芯片的表面，從而進(jìn)行相應(yīng)的反應(yīng)及檢測(cè)。

以上實(shí)例中樣品在基質(zhì)材料上排布的實(shí)現(xiàn)方式大多是先制備好蛋白質(zhì)樣品庫，再通過使用DNA芯片中成熟的機(jī)械針點(diǎn)樣系統(tǒng)或是微量液體分配系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。其實(shí)，和DNA芯片技術(shù)相似，蛋白質(zhì)芯片也可以通過原位合成的方法制備。但用這樣的方法合成小肽的成本比合成寡聚核苷酸更高，因?yàn)镈NA的組成單元只有A、G、T和C共4種核苷酸，而蛋白質(zhì)和肽是20種基本氨基酸。如果合成長為5個(gè)堿基的寡核苷酸，則需要4×5共計(jì)20張掩模板：而合成長為5個(gè)氨基酸的小肽，則需要20×5共計(jì)100張掩模板。所以幾乎無人使用光引導(dǎo)原位化學(xué)合成法制備蛋白質(zhì)芯片。

但還是有不少使用例如固相原位方法合成小肽進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)的工作，例如，早在1984年，澳大利亞Commonwealth血清實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家Geysen和荷蘭科學(xué)家Barteling通過在96孔板內(nèi)合成208種不同的6肽，包含了口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白(213個(gè)氨基酸)的所有可能的連續(xù)6肽的組合情況，用以確定其上的表位，從某種意義而言，這也可以看作是蛋白質(zhì)芯片最早的雛形。還有Reuter等用以確定限制性核酸內(nèi)切酶EcoRII的方法也是這一種。

以上實(shí)例中排布在基底材料上的固定探針都是蛋白質(zhì)或是多肽，這是狹義上的蛋白質(zhì)芯片，廣義上而言，只要能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行快速、并行分析的生物芯片都可稱之為蛋白質(zhì)芯片。那么蛋白質(zhì)芯片基底上的固定探針就并不僅僅局限于蛋白質(zhì)，也可以是核酸分子、核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物或者其他的配基、小分子的酶的底物。

例如，由Texas大學(xué)Austin分校的Ellington和Brandeis大學(xué)的Hedstrom和Stanton合作開發(fā)出的基于SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)原理的可以用以檢測(cè)蛋白質(zhì)的芯片，基片上的固定探針是核酸分子。

美國的Phylos公司的PROfile Chip中固定在基片上的探針是mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。他們對(duì)mRNA進(jìn)行修飾，在5'端加上連接臂和嘌呤毒素(puromycin)。這樣，在蛋白質(zhì)的體外翻譯過程中，嘌呤毒素可以將mRNA與其表達(dá)出的蛋白質(zhì)相連接。而且這樣的mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，解離溫度達(dá)到110℃。固定也比較方便，首先在基片上固定專門設(shè)計(jì)的寡核苷酸分子，這樣mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的RNA就可以根據(jù)Watson-Crick規(guī)則與相應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸分子連接，從而得以固定。

蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)技術(shù)主要有與DNA微陣列芯片技術(shù)中相類似的熒光或是同位素標(biāo)記方法，還有原子力顯微(AFM)技術(shù)、表面等離子體共振(SPR)技術(shù)、多光子檢測(cè)(MPD)技術(shù)、基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)技術(shù)、表面增強(qiáng)激光解吸附作用/離子化(SELDI)技術(shù)等。

蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)可以沿用DNA微陣列芯片技術(shù)中常用的熒光或是同位素標(biāo)記。例如Harvard大學(xué)的MaBeath等人將抗原固定在載玻片上，將能和這些抗原特異性結(jié)合的抗體用熒光素標(biāo)記，如Cy3、Cy5、Alexa546、BODIPY，這樣就可以通過檢測(cè)熒光判定是否發(fā)生了預(yù)期的特異性結(jié)合反應(yīng)。另外，他們還將蛋白激酶的底物固定在載玻片上，在含有各種蛋白激酶的反應(yīng)液中再加入帶有γ-33P標(biāo)記的ATP，這樣蛋白激酶就可以使底物帶上33P標(biāo)記。蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)可以直接使用DNA微陣列芯片技術(shù)中常用的掃描儀或是CCD成像。

在DNA微陣列的應(yīng)用中，標(biāo)記的通常是靶DNA，即從體內(nèi)抽提的待檢測(cè)的總RNA先反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并在這過程中摻入熒光標(biāo)記。但是對(duì)于從體內(nèi)抽提的總蛋白而言，并沒有與反轉(zhuǎn)錄相對(duì)應(yīng)的過程，熒光標(biāo)記的摻入并不像DNA那么方便，只有在待表達(dá)的基因片段中插入熒光蛋白的基因，或是給表達(dá)體系提供帶有熒光標(biāo)記的氨基酸，或是體外通過化學(xué)方法將熒光基團(tuán)接到蛋白質(zhì)上。為了解決這個(gè)問題，產(chǎn)生了標(biāo)記探針的方法。例如，前面提及的Texas大學(xué)Austin分校的Ellington和Brandeis大學(xué)的Hedstrom和Stanton計(jì)劃合作開發(fā)的基于SELEX原理的可以用以檢測(cè)蛋白質(zhì)的芯片，基片上的固定探針是核酸分子。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)連有熒光素的核酸在和特異的配基結(jié)合后，由于構(gòu)象發(fā)生一定程度的變化，從而使得熒光素發(fā)射出的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化（大約25%~40%）。這樣可以將帶有熒光素的核酸固定在基片上，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化就可以判定分子間的相互作用狀況。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)連有熒光素的核酸在和特異的配基結(jié)合后，熒光基團(tuán)的各向異性也會(huì)發(fā)生變化。也可以通過檢測(cè)各向異性判定分子間的相互作用。另外，還可以采用分子信標(biāo)技術(shù)，在固定在基片上的核酸分子的特定位置接上熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)核酸分子沒有和其他分子發(fā)生相互作用時(shí)，核酸分子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)處于淬滅狀態(tài)。當(dāng)核酸分子和其他分子發(fā)生相互作用時(shí)，核酸分子構(gòu)象改變，熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)不再相互接近，從而發(fā)射出熒光。

早在20世紀(jì)80年代初，瑞士蘇黎世IBM研究中心的科學(xué)家Binnig和Rohrer發(fā)明了掃描隧道顯微技術(shù)(scanning tunneling microscope，STM)，在此基礎(chǔ)上，1986年，Binnig、Quate和Gerber發(fā)明了原子力顯微(atomic force microscope，AFM)技術(shù)，也可以稱為掃描力顯微(scanning force microscope，SFM)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)可以用于檢測(cè)物質(zhì)的表面狀況。對(duì)力敏感的懸臂梁(cantalever)上的尖端對(duì)樣品表面作光柵掃描。懸臂與樣品表面力的作用會(huì)造成懸臂發(fā)生微小偏轉(zhuǎn)。這種偏轉(zhuǎn)可以被檢測(cè)和記錄。這樣，在探針頂端進(jìn)行化學(xué)修飾，例如加上特定的生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸），用這樣的探針對(duì)蛋白質(zhì)芯片的表面進(jìn)行掃描，就可以檢測(cè)到這些生物分子與蛋白質(zhì)芯片表面的蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。這種使用進(jìn)行了化學(xué)修飾探針的原子力顯微技術(shù)又稱為化學(xué)力顯微(chemical force microscopy，CFM)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是非常靈敏，可以在液相（如生物緩沖液）中進(jìn)行，樣品的用量少，且不需要用熒光染料或是同位素事先標(biāo)記。但是檢測(cè)速度比較慢、價(jià)格昂貴。美國的BioForce Laboratory公司和Digital Instruments Veeco公司（專門制作各種AFM儀器的著名公司）合作，計(jì)劃研制出基于AFM技術(shù)的NanoArrayer掃描儀，并進(jìn)一步推出以NanoArrayer為檢測(cè)工具的ViriChip(用于快速檢測(cè)生物樣品中病毒感染狀況）、Proteome Chip(用于快速檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)、Drug Screening Chip(用于快速分析組合化合物庫)和Immunodiagnostics Chip(用于快速分析抗原抗體相互作用)。

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)近年來被廣泛地用來研究和檢測(cè)生物分子之間的識(shí)別和特異性相互作用，是研究分子識(shí)別和分子間相互結(jié)合、相互作用的有力手段。其基本原理為，當(dāng)光線（常常使用激光）在金屬表面（通常為金，厚度一般為50~80nm)發(fā)生全反射時(shí)，一部分入射光的能量轉(zhuǎn)化為沿著金屬表面?zhèn)鞑サ臐u消失波(evanescent wave)。金屬厚度的變化可以使得發(fā)生全反射的角度發(fā)生微小的變化。這樣，在金屬上固定相應(yīng)的生物分子，如蛋白質(zhì)，在一定的化學(xué)條件下如果固定在金屬上的生物分子能夠和其他分子相結(jié)合，這就等效于改變了此位置金屬的厚度。通過檢測(cè)全反射時(shí)反射光角度是否變化，就可以判定是否發(fā)生了分子間相互作用。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，待檢測(cè)分子用量少，不需預(yù)先標(biāo)記，儀器構(gòu)造簡(jiǎn)單，如果自行構(gòu)建，成本較低。瑞典的BIAcore公司無疑站在這一領(lǐng)域的最前沿，它們研制的基于SPR技術(shù)的儀器BIAcore2000和BIAcore3000已經(jīng)面世。另外，德國的BioTul公司和美國的Texas Instruments公司也有各自的SPR產(chǎn)品問世。

多光子檢測(cè)(multi photon detection，MPD)技術(shù)是由美國的BioTraces公司發(fā)明并逐漸發(fā)展起來的一種高靈敏放射性同位素檢測(cè)方法。這種方法通過無源屏蔽(passive shielding)等四項(xiàng)技術(shù)來顯著降低背景強(qiáng)度，可以檢測(cè)到10^-21mol的同位素，這樣對(duì)實(shí)驗(yàn)中所需的同位素量的要求降低，減小了實(shí)驗(yàn)中可能對(duì)人的傷害。并且這種方法可以同時(shí)使用并區(qū)分兩種或是兩種以上的同位素標(biāo)記，便于進(jìn)行樣品的平行比較實(shí)驗(yàn)。BioTraces公司和德國的Tubingen大學(xué)合作成立了ProteoMed公司，共同進(jìn)行MPD技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面的研究工作。他們計(jì)劃將待檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品分別用不同的同位素標(biāo)記，將樣品進(jìn)行二維蛋白質(zhì)電泳(2-D electrophoresis)或是使用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，然后利用MPD技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)差異顯示(differential display of proteins，dd-PROT)的工作，從而得出蛋白表達(dá)譜。

表面增強(qiáng)激光解吸附作用/離子化(surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI)技術(shù)是由Texas醫(yī)學(xué)中心Baylor醫(yī)學(xué)院的Hutchens于20世紀(jì)90年代初發(fā)明的。其具體過程為先富集所需的蛋白（如通過蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行捕獲)，再用激光使得蛋白質(zhì)與芯片表面解吸附，解離為離子，然后通過質(zhì)譜、親和色譜-質(zhì)譜等方法進(jìn)行定性分析?，F(xiàn)在關(guān)于SELDI技術(shù)的專利共有4項(xiàng)，被美國的Molecular Analytical Systems(MAS)公司所擁有。Ciphergen Biosystems公司和LumiCyte公司得到了MAS公司的授權(quán)，現(xiàn)已經(jīng)研制出使用SELDI技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片產(chǎn)品ProteinChip Array和SELDI BioChips。

質(zhì)譜是一種十分靈敏的檢測(cè)技術(shù)，形象地說，質(zhì)譜技術(shù)是一項(xiàng)通過將待測(cè)樣品分子用“錘子”敲擊為碎片（離子或是中性粒子）并加以檢測(cè)從而確定初始樣品分子性質(zhì)的技術(shù)。在傳統(tǒng)的質(zhì)譜方法中，待測(cè)樣品分子的分子量通常在10kD以下，所使用的“錘子”一般是高速原子轟擊(fast atom bombardment，F(xiàn)AB)和電子濺射離子化(electron spray ionization，ESI)這兩種方法，并且通常將樣品分子分為許多碎片。而對(duì)于蛋白質(zhì)而言，通常分子量都在10kD以上，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如果被解離得過碎，會(huì)給讀譜帶來困難，為了解決這些問題，1988年Karas和Hillenkamp研制出了基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)技術(shù)，主要用于對(duì)生物大分子（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸）進(jìn)行分析，可以分析分子量高達(dá)1000kD的蛋白質(zhì)，靈敏度達(dá)到10^-15ml。待分析的生物大分子樣品和對(duì)光敏感的化合物(matrix)，如龍膽酸(gentisic acid)、α-藍(lán)-4-羥基苯乙烯酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)，一起包埋進(jìn)固體介質(zhì)中共結(jié)晶形成晶體，然后用長波長激光脈沖照射，這樣對(duì)光敏感的化合物吸收激光能量，使得蛋白質(zhì)分子離子化，并且?guī)缀醪唤怆x為碎片。然后離子被加速后通過飛行管（管長約數(shù)米，飛行時(shí)間約100ms)分離，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。MALDI-TOF/MS技術(shù)的缺點(diǎn)在于待測(cè)樣品的制備比較困難，要求比較純的蛋白質(zhì)樣品，并且要選擇合適的對(duì)光敏感的化合物和固體介質(zhì)，以使它們可以很好地共結(jié)晶。而且這項(xiàng)技術(shù)無法進(jìn)行定量測(cè)定，只能定性測(cè)定，美國的Intrinsic Bioprobes公司的高通量蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)MASSAY就是利用MALDI-TOF/MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

蛋白質(zhì)芯片的新技術(shù)、新方法層出不窮。隨著蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的日臻成熟，必將大力推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，讓我們了解更多的奇妙的生命現(xiàn)象。