一、芯片的制備
芯片制備的基本原理。
芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三個方面。
1.支持物的預(yù)處理
目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實性材料和膜性材料。實性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價交聯(lián)而被保護(hù)起來，合成時在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的羥基等基團(tuán)形成共價結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針。
2.原位合成芯片的制備
原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術(shù)或壓電打?。╬iezoelectric printing）技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。
3.DNA微集陳列的制備
DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。
二、樣品的準(zhǔn)備
樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過程。
1．樣品的分離純化
主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個過程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。
2．樣品的擴(kuò)增
測定時往往需要較多的樣品分子，因此對于分離獲得的基因組DNA通過PCR技術(shù)直接擴(kuò)增，對于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。
3.樣品的標(biāo)記
標(biāo)記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴(kuò)增的過程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測同位素標(biāo)記的樣品。
樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。
三、分子雜交
芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進(jìn)行的復(fù)雜過程。
依據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時間。通常采用的條件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑。也可采用65℃，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt試劑或者65℃，10%SDS，7%PEG-800。
雜交過程類似Northern或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測。
四、檢測分析
芯片雜交信號的檢測可應(yīng)用熒光檢測法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測法是最常應(yīng)用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測器檢測。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號，不完全雜交顯示較弱的信號。
