自然界本身就具有二氧化碳的生物轉(zhuǎn)化利用能力。目前，在好氧和厭氧生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了六種天然的生物固碳途徑，包括廣泛存在于植物和藻類中的卡爾文循環(huán)（光合作用中的暗反應(yīng)即固碳反應(yīng)）在內(nèi)。

然而，這些天然固碳途徑的步驟較長（大多包含十幾步生化反應(yīng)），即便在微生物中實(shí)現(xiàn)這些天然固碳途徑的異源重構(gòu)，由于并沒有改變固碳途徑的基本結(jié)構(gòu)，仍然不能實(shí)現(xiàn)二氧化碳的快速高效生物轉(zhuǎn)化。

一般情況下，反應(yīng)步驟越多，效率就越低。為了進(jìn)一步縮短生物固碳途徑的反應(yīng)步驟，提高固碳效率，中國科學(xué)院微生物研究所李寅研究員課題組基于生化反應(yīng)熱力學(xué)和動力學(xué)計(jì)算，歷時五年設(shè)計(jì)出目前最小化的、僅有四步反應(yīng)的人工固碳循環(huán)。

目前，這項(xiàng)研究成果已于去年 12 月 28 日以 “A Minimized Synthetic Carbon Fixation Cycle” 為題發(fā)表在 ACS Catalysis 上。這項(xiàng)研究不僅為二氧化碳的人工生物轉(zhuǎn)化開辟了全新途徑，同時也為探索地球早期生物如何進(jìn)行二氧化碳固定提供了新的模型。

圖｜發(fā)表的論文（來源：ACS Catalysis）

酶和能量是縮短固碳循環(huán)的關(guān)鍵

所謂固碳，就是把無機(jī)碳轉(zhuǎn)化成有機(jī)碳，固碳的過程本質(zhì)上是一個氧化還原反應(yīng)。“由于二氧化碳中的碳處于比較高的價態(tài)（+4 價），而有機(jī)碳中的碳處于比較低的價態(tài)，因此，需要較大的還原力，才能推動這個反應(yīng)發(fā)生?！?論文第一作者、中國科學(xué)院微生物研究所肖璐博士告訴生輝。

2014 年，肖璐在湖南大學(xué)本科畢業(yè)后被保送中科院微生物所讀直博，博士期間她主攻酶工程和合成生物固碳方向。去年年底，她博士畢業(yè)，接下來將繼續(xù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行博士后研究工作。

圖｜肖璐博士所在的李寅研究員課題組（來源：受訪者）

“在 POAP 循環(huán)中，我們使用的是丙酮酸合酶?！?她表示。一般情況下，丙酮酸合酶（PFOR）催化的是丙酮酸氧化脫羧，是一個釋放二氧化碳的反應(yīng)?！叭粝朐?POAP 循環(huán)中利用丙酮酸合酶固碳，需要將丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)逆轉(zhuǎn)，催化乙酰輔酶 A 還原羧化生成丙酮酸。但這個反應(yīng)需要較高的還原力推動，我們采用的方式為在厭氧條件下利用低電勢的電子供體提供足夠的還原力來驅(qū)動反應(yīng)。”

據(jù)介紹，肖璐在研究期間，通過測試一系列低電勢的電子供體鐵氧還蛋白（Fd），發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱氫桿菌的 Fd2 對丙酮酸合酶的還原羧化反應(yīng)具有較強(qiáng)的推動作用，以 Fd2 作為電子供體，可以驅(qū)動熱纖梭菌來源的丙酮酸合酶實(shí)現(xiàn)乙酰輔酶 A 的還原羧化。

圖｜POAP 循環(huán)（來源：論文）

如上圖所示，POAP 循環(huán)的四步反應(yīng)分別由丙酮酸羧化酶（PYC）、草酰乙酸乙?；饷福∣AH）、乙酸 - CoA 連接酶（ACS）、丙酮酸合酶（PFOR）分別進(jìn)行催化，這四種酶的首字母組成了 “POAP”，這就是 POAP 循環(huán)名稱的由來。

在這四步反應(yīng)中，由丙酮酸合酶和丙酮酸羧化酶催化的這兩步反應(yīng)均為固碳反應(yīng)。POAP 循環(huán)每運(yùn)行一輪，可以轉(zhuǎn)化兩分子二氧化碳生成一分子草酸，消耗兩分子 ATP 和一分子還原力。據(jù)了解，POAP 循環(huán)可以在無氧環(huán)境和較高溫度（50°C）下實(shí)現(xiàn)二氧化碳固定，試驗(yàn)測得 POAP 循環(huán)的固碳速率為 8.0±1.8 nmol CO?/min/mg 酶，總轉(zhuǎn)換數(shù)為 5 mol 草酸 /mol 酶。

相較于傳統(tǒng)工業(yè)固碳的實(shí)現(xiàn)條件極為苛刻（比如需要高溫高壓），生物固碳的實(shí)現(xiàn)條件則要 “溫和” 得多?！暗S之而來的代價是步驟非常多，需要一步一步地進(jìn)行還原。所以，想要縮短生物固碳途徑，就意味著一步反應(yīng)需要實(shí)現(xiàn)長固碳途徑中多步反應(yīng)的功能。” 肖璐指出。

據(jù)介紹，想要設(shè)計(jì)出更短的人工固碳循環(huán)，首先需要找到合適的酶；其次，固碳途徑 “長步驟” 是按部就班地進(jìn)行一步步反應(yīng)（逐漸吸收能量），而變?yōu)?“短步驟”，則需要更高的能量來進(jìn)行驅(qū)動。所以，“酶” 和 “能量” 是縮短固碳循環(huán)的兩個關(guān)鍵點(diǎn)。

除此之外，丙酮酸合酶屬于厭氧酶，其在大腸桿菌中異源表達(dá)、組裝、純化也比較困難?！拔覀冏隽撕芏啾磉_(dá)純化的條件優(yōu)化，最后選擇了嗜熱菌來源的丙酮酸合酶，因?yàn)槠浞磻?yīng)溫度比較高，使得這個反應(yīng)更容易發(fā)生。” 肖璐說道，“然后又嘗試了很多天然和人工合成的電子供體，找到了比較適合的電子供體來推動這個反應(yīng)的發(fā)生。最終，實(shí)現(xiàn)了將原來十幾步反應(yīng)縮短為四步。” 她補(bǔ)充道。

理論層面，構(gòu)成一個最小固碳循環(huán)需要三步反應(yīng)，而 POAP 循環(huán)只含有四步反應(yīng)，接近理論最小值，也是目前經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的最小化的人工固碳循環(huán)?！翱s短人工固碳途徑不但能夠提高固碳速率，同時還使得固碳過程更為簡單，所采用的酶種類更少，反應(yīng)的條件也更容易匹配?！?肖璐指出。

談及下一步的研究方向，肖璐表示，大的方向依然還是針對固碳領(lǐng)域，細(xì)分的方向，比如設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的固碳循環(huán)，以及運(yùn)用合成生物學(xué)的手段對酶進(jìn)行基因改造，對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，然后進(jìn)行優(yōu)化、改造和篩選等。

人工固碳循環(huán)效率已超過天然途徑

在肖璐看來，全球?qū)用嫒斯す烫佳芯恐?，有兩大具有代表性的里程碑事件?/span>CETCH 循環(huán)和 ASAP 途徑。

2016 年，德國馬普陸地微生物研究所在 Science 雜志上報(bào)道了一種自然界中不存在的全新固碳途徑 ——CETCH 循環(huán)，這是第一條人工合成的固碳途徑，同時也是已知六條天然固碳途徑之外的第七條固碳途徑。

圖｜CETCH 循環(huán)（來源：Science）

據(jù)了解，CETCH 循環(huán)以巴豆烯酰輔酶 A 羧化酶作為途徑設(shè)計(jì)的起點(diǎn)，經(jīng)過 12 步生化反應(yīng)，最終產(chǎn)物為乙醛酸。相較于其他天然好氧固碳途徑而言，CETCH 循環(huán)的步驟更短、能效更高，固碳的效率比卡爾文循環(huán)高出 20%，是生物固碳領(lǐng)域的一個突破，這項(xiàng)研究意味著采用源于自然的固碳元件也有可能創(chuàng)造出超越自然的非天然固碳途徑。

“當(dāng)時也正是 POAP 循環(huán)進(jìn)行最初設(shè)計(jì)和定形的階段，CETCH 循環(huán)的出現(xiàn)讓我們覺得人工固碳很有意義，堅(jiān)定了繼續(xù)做下去的信念?！?肖璐表示。

另外一個是由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所設(shè)計(jì)的人工合成淀粉途徑 ——ASAP（The artificial starch anabolic pathway）。目前，淀粉主要由玉米等農(nóng)作物通過光合作用固定二氧化碳進(jìn)行合成，其中涉及 60 余步生化反應(yīng)以及復(fù)雜的生理調(diào)控，其理論能量轉(zhuǎn)化效率僅為 2% 左右。

ASAP 途徑是從頭設(shè)計(jì)出的一條包含 11 步反應(yīng)的人工合成新途徑，利用無機(jī)催化劑將氫氣與二氧化碳轉(zhuǎn)化為甲醇，通過蛋白質(zhì)與模塊工程構(gòu)建多步的體外生物酶催化體系并最終合成淀粉。數(shù)據(jù)顯示，ASAP 途徑的淀粉合成速率是玉米淀粉合成速率的 8.5 倍，理論能量轉(zhuǎn)化效率是玉米淀粉的 3.5 倍。

圖｜ASAP 途徑（來源：Science）

ASAP 途徑的設(shè)計(jì)成功意味著未來可以像工業(yè)釀造啤酒一樣在車間生產(chǎn)淀粉，而不再需要種植玉米等農(nóng)作物，這將顛覆傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)，節(jié)省超過 90% 的土地和淡水資源，以及肥料、農(nóng)藥等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料。

談及人工固碳的產(chǎn)業(yè)層面，肖璐表示，現(xiàn)階段，國內(nèi)外單純地利用生物固碳途徑的產(chǎn)業(yè)尚未形成?！霸谖铱磥恚斯す烫纪緩降难芯窟€處于起步階段，距離產(chǎn)業(yè)化還有很長的路要走?！?肖璐表示?！?/span>我們設(shè)計(jì)的 POAP 循環(huán)的固碳速率是目前研究領(lǐng)域比較高的，但整體來看依然處于比較低的水平，而且通量也很低，現(xiàn)階段還處于基礎(chǔ)研究階段。” 她補(bǔ)充到。

據(jù)介紹， 國外與固碳相關(guān)的產(chǎn)業(yè)，大部分都是利用微生物將工業(yè)廢氣 / 尾氣轉(zhuǎn)化為生物能源。目前，全球范圍已有數(shù)家公司實(shí)現(xiàn)了基于二氧化碳的商業(yè)化生物制造。例如，美國生物技術(shù)企業(yè) Algenol 和 LanzaTech 分別利用微藻和梭菌將二氧化碳和一氧化碳轉(zhuǎn)化為生物燃料。